食品中合成著色劑主要是以人工方法進行化學合成的有機色素類，按其化學結構不同可分為偶氮類色素和非偶氮類色素，偶氮類色素按溶解性不同又可分為油溶性和水溶性兩類。合成類色素中還包括色澱。
食品中合成著色劑的種類很多，國際上允許使用的有30餘種，我國允許使用的主要有莧菜紅、胭脂紅、赤蘚紅、新紅、玫瑰紅、檸檬黃、日落黃、亮藍、靛藍、牢固綠等。
6.1高效液相色譜法
1)原理
食品中的合成著色劑經聚醯胺吸附法或液一液分配法提取後，製成水溶液，注入高效液相色譜儀，經反相色譜分離，根據保留時間定性和與峰面積比較進行定量。
利用高效液相色譜法測定食品中合成著色劑的最小檢出量為：新紅5ng、檸檬黃4ng、莧菜紅6ng、胭脂紅8ng、日落黃7ng、赤蘚紅18ng、亮藍26ng。當進樣量為0.
025g樣品時，最低檢出濃度分別為0.2、0.16、0.
24、0.32、0.28、0.
72、1.04mg／kg。
2)儀器和試劑
(1)儀器高效液相色譜儀，帶紫外檢測器。
(2)試劑
⑴正己烷。分析純。
⑵鹽酸。分析純。
⑶乙酸。
⑷甲醇：經濾膜(0.45μm)過濾。
⑸聚醯胺粉(尼龍6)：過200目篩。
⑹乙酸銨溶液(0.02mol／l)：稱取1.54g乙酸銨，加水至1000ml，溶解，經濾膜(0.45μm)過濾。
⑺氨水：量取氨水2ml，加水至100ml，混勻。
⑻甲醇一甲酸(6+4)溶液：量取甲醇60ml，甲酸40ml，混勻。
⑼檸檬酸溶液：稱取20g檸檬酸(c6h8o7h2o)，加水至100ml，溶解混勻。
⑽無水乙醇一氨水一水(7+2+1)溶液：量取無水乙醇70ml、氨水20ml、水10ml，混勻。
⑾三正辛胺正丁醇溶液(5％)：量取三正辛胺5ml，加正丁醇至100ml，混勻。
⑿飽和硫酸鈉溶液。
⒀ph6的水：水加檸檬酸溶液調ph到6。
⒁合成著色劑標準溶液：準確稱取按其純度折算為100%質量的檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、新紅、赤蘚紅、亮藍、靛藍各0.1000g，置100ml容量瓶中，加ph6的水到刻度。
此溶液含著色劑1.00mg／ml。
⒂合成著色劑標準使用液：臨用時合成著色劑標準溶液加水稀釋20倍，經濾膜(0.45μm)過濾。配成每毫公升相當50.0μg的合成著色劑。
3)操作步驟
(1)樣品處理
①橘子汁、果味水、果子露、汽水等：稱取20.0～40.0g，放入100ml燒杯中。含二氧化碳樣品需要加熱以驅除二氧化碳。
②配製酒類：稱取20.0～40.0g，放l00ml燒杯中，加小碎瓷片數片，加熱驅除乙醇。
③硬糖、蜜餞類、澱粉軟糖等：稱取5.00～10.00粉碎樣品，放人l00ml小燒杯中，加水30ml，溫熱溶解，若樣品溶液ph較高，用檸檬酸溶液調ph到6左右。
④巧克力豆及著色糖衣製品：稱取5.00～10.00g放入100ml小燒杯中，用水反覆洗滌色素，到巧克力豆無色素為止，合併色素漂洗液為樣品溶液。
(2)色素提取
①聚酞胺吸附法：樣品溶液加檸檬酸溶液調ph至6，加熱至60℃，將1g聚酞胺粉加少許水調成粥狀，倒入樣品溶液中，攪拌片刻，以g3垂熔漏斗抽濾，用60℃ph4的水洗滌3～5次，然後用甲醇一甲酸混合溶液洗滌3～5次(含赤蘚紅的樣品用液一液分配法處理)，再用水洗至中性，用乙醇一氨水一水混合溶液解吸3～5次，每次5ml，收集解吸液，加乙酸中和，蒸發至近幹，加水溶解，定容至5ml經濾膜(0.45μm)過濾，取l0μl。
進行hplc分析。
圖8—6八種著色劑色譜分離圖
1.新紅；2.檸檬黃；3.莧菜紅；
4.靛藍；5.胭脂紅；6.日落黃；
7.亮藍；8.赤蘚紅
②液一液分配法(適用於含赤蘚紅的樣品)：將製備好的樣品溶液放入分液漏斗中，加2ml鹽酸、三正辛胺正丁醇溶液(5％)10～20ml，充分振搖提取，靜置分取有機相，重複提取2～3次，每次10ml，直至有機相無色，合併有機相，用飽和硫酸鈉溶液洗2次，每次10ml，分取有機相，放於蒸發皿中，水浴加熱濃縮至l0ml，轉移至分液漏斗中，加60ml正己烷，混勻，加氨水提取2～3次，每次5ml，合併氨水溶液層(含水溶性酸性色素)，用正己烷洗2～3次，分取氨水層加乙酸調成中性，水浴加熱蒸發至近幹，加水定容至5ml。
經濾膜(0.45μm)過濾，取10μl進高效液相色譜儀。如圖8—6所示。
(3)高效液相色譜分析參考條件
①色譜柱：ywg-cl8，10μm不鏽鋼柱，4.6mm×250mm。
②流動相：甲醇一乙酸銨溶液(0.02mol／l)(ph4)。
③梯度洗脫：用濃度為20％～35％的甲醇洗脫5min；用濃度為35％～98％的甲醇5min；用濃度為98％的甲醇繼續洗脫6min。
④流速：1ml／min。
⑤紫外檢測器，波長254nm。
(4)測定取相同體積樣液和合成著色劑標準使用液分別注入高效液相色譜儀，根據保留時間定性，外標峰面積法定量。
4)結果計算
式中：x——樣品中著色劑的含量，mg／g；
m1——樣液中著色劑的質量，μg；
v2——樣品進樣體積，ml；
v1——樣品稀釋總體積，ml；
m2——樣品質量，g。
結果的表述：保留算術平均值的二位有效數，允許相對誤差≤10％。
6.2薄層色譜法及紙色譜法
1)原理
水溶性酸性合成著色劑在酸性條件下，被聚醯胺吸附後與食品中的其他成分分離，經過濾、洗滌及在鹼性溶液(乙醇一氨)中解吸附，再經薄層色譜法或紙色譜法純化、洗脫後，用分光光度法進行測定，可與標準比較定性、定量。
2)儀器和試劑
(1)儀器
①可見分光光度計。
②微量注射器或血色素吸管。
③展開槽：25cm×6cm×4cm。
④層析缸。
⑤濾紙：中速濾紙，紙色譜用。
⑥玻砂漏斗g3(50ml)。
⑦抽氣裝置。
⑧恆溫水箱。
⑨薄層板：5cm×20cm。
⑩電吹風機。
(2)試劑
⑴石油醚：沸程60～90℃。
⑵甲醇。
⑶聚醯胺粉(尼龍6)：200目，使用前於100℃洗化1h，放冷密封備用。
⑷矽膠g。
⑸硫酸(1+10)。
⑹甲醇一甲酸溶液(6+4)。
⑺氫氧化鈉溶液(50g／l)。
⑻鹽酸(1+10)。
⑼乙醇(50％)。
⑽乙醇一氨溶液：取1ml氨水，加乙醇(70%)至l00ml。
⑾ph6的水：用檸檬酸溶液(200g／l)調蒸餾水的ph至6。
⑿海砂、碎瓷片：先用鹽酸(1+10)煮沸15min，用水漂洗至中性，再用氫氧化鈉溶液(50g/l)煮沸15min，用水漂洗至中性，再於105℃乾燥，儲於具玻璃塞的瓶中備用。
⒀檸檬酸溶液(200g／l)。
⒁鎢酸鈉溶液(100g／l)。
⒂展開劑。
a.正丁醇一無水乙醇一氨水(1%)(6+2+3)：供紙色譜用。
b.正丁醇一吡啶一氨水(1％)(6+3+4)：供紙色譜用。
c.甲乙酮一丙酮一水(7+3+3)：供紙色譜用。
d.甲醇一乙二胺一氨水(10+3+2)：供薄層色譜用。
e.甲醇一氨水一乙醇(5+1+10)：供薄層色譜用。
f.檸檬酸鈉溶液(25g／l)一氨水一乙醇(8+1+2)：供薄層色譜用。
⒃合成著色劑標準儲備液：準確稱取按其純度折算為100％質量的檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、新紅、赤蘚紅、亮藍、靛藍各0.100g，加少量ph為6的水溶解，再轉移至100ml容量瓶中並定容至刻度。
配製成的各著色劑標準儲備液濃度為1.00mg／ml。
⒄合成著色劑標準使用液：臨用時吸取合成著色劑標準溶液各5.0ml，分別置於50ml容量瓶中，加ph6的水稀釋至刻度。此溶液每毫公升相當於0.10mg著色劑。
3)操作步驟
(1)樣品的處理
①果味水、果子露、汽水：稱取50.0g樣品於100ml燒杯中。汽水需加熱驅除二氧化碳。
②配製酒：稱取100.0g樣品於100ml燒杯中，加碎瓷片數塊，加熱驅除乙醇。
③硬糖、蜜餞類、澱粉軟糖：稱取5.00或10.0g粉碎的樣品，加30ml水，溫熱溶解，若樣液ph較高，用檸檬酸溶液調至ph4左右。
④奶醣類：稱取10.0g粉碎均勻的樣品，加30ml乙醇一氨溶液溶解，置水浴上濃縮至約20ml，立即用硫酸溶液(1+10)調至微酸性，再多加1.
0ml硫酸，然後加入1ml鎢酸鈉溶液，使蛋白質沉澱，過濾後，用少量水洗滌，收集濾液。再用檸檬酸調ph至4。
⑤蛋糕類：稱取10.0g粉碎均勻的樣品，加海砂少許，混勻，用熱風吹乾樣品(用手摸已乾燥即可)，加入30ml石油醚攪拌。
放置片刻，傾出含脂肪的石油醚，如此重複處理三次，以除去脂肪。吹乾後研細，全部倒人玻砂漏斗中，用乙醇_氨溶液提取色素，直至著色劑全部提完，以下按奶醣類自「置水浴上濃縮至約20ml」起依法操作。
(2)吸附分離將處理後所得的溶液加熱至70℃，用檸檬酸溶液(200g／l)調ph至4，加入0.5～1.0g聚醯胺粉充分攪拌，使著色劑完全被吸附，如溶液還有顏色，可以再加一些聚醯胺粉。
將吸附著色劑的聚醯胺全部轉入玻砂漏斗中抽濾，用已被檸檬酸酸化至ph4的70℃熱水反覆洗滌，每次20ml，邊洗邊攪拌。若含有天然著色劑，再用甲醇一甲酸溶液洗滌1～3次，每次20ml，至洗液無色為止。再用70℃熱水充分攪拌、洗滌沉澱，至洗液為中性。
然後用乙醇一氨溶液分次解吸全部著色劑，收集全部解吸液，於水浴上驅氨。
如果為單色，則用水準確稀釋至50ml，用分光光度法進行測定。如果為多種著色劑的混合液，則進行紙色譜或薄層色譜法分離後測定，即可將上述溶液置水浴上濃縮至2ml後移入5ml容量瓶中，用乙醇(50%)洗滌容器，洗液並人容量瓶中並稀釋至刻度。
(3)定性分析
①紙色譜法：取層析濾紙，在距底邊2cm處用鉛筆劃一條點樣線，於點樣線上間隔2cm標記刻度。在每個刻度處分別點3～10μl樣品純化溶液和l～2μl著色劑標準溶液，各點直徑不超過3mm，懸掛於分別盛有正丁醇一無水乙醇一氨水(1％)(6+2+3)、正丁醇一吡啶一氨水(1％)(6+3+4)的展開劑的層析缸中，用上行法展開，待溶劑前沿展至15cm處，將濾紙取出於空氣中自然晾乾，與標準色斑移動的距離(rf值)進行比較定性。
如rf值相同即為同一色素。
也可取0.5ml樣液，在起始線上從左到右點成條狀，紙的左邊點著色劑標準溶液，依法展開，晾乾後先定性後再供定量用。靛藍在鹼性條件下易褪色，可用甲乙酮一丙酮一水(7+3+3)展開劑。
②薄層色譜法。
薄層板的製備：稱取1.6g聚醯胺粉、0.
4g可溶性澱粉及2g矽膠g，置於合適的研缽中，加15ml水研勻後，立即置塗佈器中鋪成厚度為0.3mm的板。在室溫晾乾後，於80℃乾燥1h，置乾燥器中備用。
點樣：在距離板底邊2cm處將0.5ml樣液，從左到右點成與底邊平行的條狀，板的左邊點2μl色素標準溶液。
展開：莧菜紅與胭脂紅用甲醇一乙二胺一氨水(10+3+2)展開劑，靛藍與亮藍用甲醇一氨水一乙醇(5+1+10)展開劑，檸檬黃與其他著色劑用檸檬酸鈉溶液(25g／l)一氨水一乙醇(8+1+2)展開劑。取適量展開劑倒人展開槽中，將薄層板放入展開，待著色劑明顯分開後取出，晾乾，與標準斑移動的距離(rf值)進行比較定性。
如rf值相同即為同一色素。
(4)定量分析
①標準曲線製備：分別吸取0.00、0.
50、1.00、2.00、3.
00、4.00ml胭脂紅、莧菜紅、檸檬黃、日落黃色素標準使用溶液，或0.0、0.
2、0.4、0.6、0.
8、1.0ml亮藍或靛藍色素標準使用溶液，分別置於10ml比色管中，各加水稀釋至刻度。用1cm比色杯，以零管調節零點，於一定波長下(胭脂紅510nm，莧菜紅520nm，檸檬黃430nm，日落黃482nm，亮藍627nm，靛藍620nm)，測定吸光度，分別繪製標準曲線。
②樣品的測定：將紙色譜的條狀色斑剪下，用少量熱水洗滌數次，直至提取完全，合併提取液於人10ml比色管中，冷卻後加水至刻度。-
將薄層色譜的條狀色斑包括有擴散的部分，分別用刮刀刮下，移入漏斗中，用乙醇一氨溶液解吸著色劑，少量反覆多次至解吸液於蒸發皿中，於水浴上揮去氨，移人10ml比色管中，加水至刻度，做比色用。
將上述樣品液分別用1cm比色杯，以零管調節零點，按標準曲線繪製操作，在一定波長下測定樣品液的吸光度，並與標準系列比較定量或與標準色列目測比較。
4)結果計算
式中：x——樣品中著色劑的含量，g／k；
m1——樣品比色液中著色劑的質量，mg；
v1——樣品解吸後總體積，ml；
v2——樣液點板(紙)體積，ml；
m——樣品的質量(或體積)，g(或ml)。
結果的表述：保留算術平均值的二位有效數。
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