品名：黃連上清片
批號：20160101
******藥業有限責任公司
1.概述
微生物限度檢查法系檢查非規定滅菌製劑及其原料、輔料受微生物汙染程度的方法。檢查專案包括需氧菌總數、黴菌數和酵母菌總數及控制菌檢查。當建立產品的微生物限度檢查法時，應進行需氧菌、黴菌和酵母菌計數方法的適用性試驗和控制菌檢查方法的適用性試驗，以確認所採用的方法適合於該產品的需氧菌、黴菌和酵母菌數的測定和控制菌檢查。
我公司生產的品種黃連上清片由於依照《中國藥典》2010版的檢查方法驗證，細菌、黴菌和酵母菌、控制菌檢查均採用平皿法。故現公升級為《中國藥典》2015版，需氧菌、黴菌和酵母菌及控制菌擬採用平皿法重新進行方法適用性試驗，以確認平皿法仍然適用於該品種的微生物限度檢查。
2.驗證內容
2.1培養基確認
經檢查，上述培養基**於北京奧博星科技****，是我公司審計的合格**商，並經過培養基適用性實驗檢查合格，可以使用。
確認人確認日期：
2.2檢查用培養基配製方法
上述培養基按照規定的方法配製、滅菌後可以使用。
確認人確認日期：
2.3使用裝置
上述裝置經過校準合格，裝置狀態良好，可以使用。
確認人確認日期：
2.4實驗用菌株
上述傳代後待使用的菌種在5代之內，菌種特徵明顯，無變異，可以使用。
確認人確認日期：
2.5試驗方法
2.5.1供試品製備
取供試品 10g加ph7.0氯化鈉-蛋白腖緩衝液至100ml→1:10供試液，該供試液可以用於需氧菌、黴菌和酵母菌、控制菌的檢查。
2.5.2菌液的製備
2.5.2.
1取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的胰酪大豆腖瓊脂斜面培養物一鉑金餌，加入胰酪大豆腖液體培養基中置30～35℃培養箱中培養18～24h，取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的胰酪大豆腖液體培養物1ml加入ph7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液中，製成10-1 的菌液，依法10倍稀釋至10～7， 分取各菌懸液1ml注入平皿中，立即傾注胰酪大豆腖瓊脂培養基約20ml，各菌懸液平行製備兩個平皿，平皿法培養計數，取小於100cfu/ml的菌液備用。
2.5.2.
2取白色念珠菌的沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養物，加入沙氏葡萄糖液體培養基中置20～25℃培養箱中培養2～3天，取白色念珠菌的沙氏葡萄糖液體培養物1ml加入9mlph7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液中，製成10-1 的菌液，依法10倍稀釋至10～7，取菌懸液1ml注入平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基約20ml，各菌懸液平行製備兩個平皿，平皿法培養計數，取小於100cfu/ml的菌液備用。
2.5.2.
3取黑麴黴的新鮮培養物接種沙氏葡萄糖瓊脂斜面上，20-25℃培養5-7天，加入3-5ml含0.05%聚山梨酯80的ph7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液中，將孢子洗脫。
取1ml加入含0.05%聚山梨酯80的9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，製成10-1 的菌液，依法10倍稀釋至10～7，取菌懸液1ml注入平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基25ml，各菌懸液平行製備兩個平皿，平皿法培養計數，取小於100cfu/ml菌液備用。
2.5.3菌落計數
2.5.3.1分別取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌與枯草芽孢桿菌菌液各1ml接種至胰酪大豆腖瓊脂培養基中（每種菌液接種2個平皿），置30～35℃培養不超過3天；
2.5.3.2分別取白色念珠菌、黑曲黴菌菌液各1ml接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養基中（每種菌液接種2個平皿），置30～35℃培養，不超過5天。
2.5.3.3菌落計數結果見下表（2個平皿計數取平均值）
菌落計數結果（cfu∕ml）
2.5.4需氧菌、黴菌和酵母菌計數方法適用性試驗
2.5.4.1供試液製備
取供試品10g加ph7.0氯化鈉-蛋白腖緩衝液至100ml，混勻，做為供試液。
2.5.4.2實驗條件
2.5.4.2.1需氧菌培養溫度：30～35℃ 3～5天
2.5.4.2.2黴菌和酵母菌培養溫度：20～25℃ 5～7天
2.5.4.3試驗方法
2.5.4.3.1試驗組（供試液+菌液+培養基）
a.分別取3份供試液各10ml，分別加入0.1ml不大於100cfu的銅綠假單胞菌液、金黃色葡萄球菌液、枯草芽孢桿菌液，混勻後取其中1ml注皿，傾注溫度不超過45℃的胰酪大豆腖瓊脂培養基約20ml，置30～35℃培養箱中培養不超過3天，計數，每株試驗菌平行製備2個平皿。
b.分別取2份供試液各10ml，分別加入0.1ml濃度不大於100cfu白色念珠菌液、黑麴黴菌液，混勻後分別取其中1ml注皿,傾注溫度不超過45℃的胰酪大豆腖瓊脂培養基約20ml，置30～35℃培養箱中培養不超過5天，計數，每株試驗菌平行製備2個平皿。
2.5.4.3.2供試品對照組（供試液+稀釋液+培養基）
取供試液4ml，分別注入4個無菌平皿中（每皿1ml）；將其分成2組，分別加入0.1mlph7.0氯化鈉-蛋白腖緩衝液，混勻後一組傾注溫度不超過45℃的胰酪大豆腖瓊脂培養基，另一組傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基，置與試驗組相同條件下培養, 計數。
2.5.4.3.3菌液對照組（稀釋液+菌液+培養基）
分別取5份稀釋液各10ml，分別加入0.1ml濃度不大於100cfu的5種菌液，混勻後每份取2 ml分別注2個無菌平皿（每皿1 ml）中，傾注溫度不超過45℃的胰酪大豆腖瓊脂培養基（銅綠假單胞菌液、金黃色葡萄球菌液、枯草芽孢桿菌液注入胰酪大豆腖瓊脂培養基）和沙氏葡萄糖瓊脂培養基（白色念珠菌液、黑麴黴菌液注入沙氏葡萄糖瓊脂培養基），置與試驗組相同條件下培養, 計數。每株試驗菌平行製備2個平皿。
2.5.4.3.4陰性對照組（稀釋液+培養基）
另分別取2份各1mlph7.0氯化鈉-蛋白腖緩衝液注入平皿, 傾注溫度不超過45℃的胰酪大豆腖瓊脂培養基，置30～35℃培養箱中培養不超過3天。傾注溫度不超過45℃的沙氏葡萄糖瓊脂培養基約20ml，置30～35℃培養箱中培養不超過5天。
2.5.4.4結果判定依據
2.5.4.4.1 陰性對照組應無菌生長，進行下一項計算。否則實驗失敗，不允許進行下一項判定。
2.5.4.4.2 試驗組的菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值應在0.5～2範圍內。
比值=試驗組菌落數-供試品對照組的菌落數
菌液對照組菌落數
2.5.4.5試驗結果
2.5.4.5.1陰性對照組結果：無菌生長。
2.5.4.5.2需氧菌總數計數結果
品名：黃連上清片批號:
結果判定: 需氧菌總數計數實驗陰性對照無菌生長，該實驗有效； 5種菌的試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值應在0.5～2範圍內，符合藥典要求。
檢驗人日期複核人日期：
2.5.4.5.3黴菌和酵母菌計數方法適用性試驗結果
2.5.4.5.3.1陰性對照組結果：無菌生長。
2.5.4.5.3.2黴菌和酵母菌總數計數結果
品名：黃連上清片批號:
結果判定: 黴菌和酵母菌總數計數實驗陰性對照無菌生長，該實驗有效； 2種菌的試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值應在0.5～2範圍內，符合藥典要求。
檢驗人日期複核人日期
2.5.5控制菌微生物檢測方法適用性試驗（包括大腸埃希菌、沙門菌、耐膽鹽革蘭陰性菌）
2.5.5.1大腸埃希菌檢測方法適用性實驗
2.5.5.1.1供試液製備
取供試品10 g加ph7.0氯化鈉-蛋白腖緩衝液至100ml，混勻，做為供試液。
2.5.5.1.2 供試品組（供試液+培養基）
取供試液10ml，接種至不超過45℃的胰酪大豆腖液體培養基100ml中，置30～35℃培養24小時, 取上述培養物1ml接種至100ml麥康凱液體培養基中，42～44℃培養48小時。取麥康凱液體培養物劃線接種於麥康凱瓊脂培養基平板上30～35℃培養72小時。應無菌生長。
藥品微生物限度檢查方法驗證試驗
吉林九鑫藥業 檢驗原始記錄 1 檢品名稱 更年寧檢品批號 20111001 2 驗證依據 中國藥典2010年版 微生物限度檢查方法驗證試驗 3 儀器 4 培養基 5 細菌 黴菌及酵母菌計數方法的驗證 5.1 驗證用菌種 大腸埃希菌枯草芽孢桿菌金黃色葡萄球菌白色念球菌黑曲黴菌 巿藥檢所 5 2菌液製備...
微生物限度檢驗方法驗證方案
1.適用範圍 本方案適用於本公司各品種微生物限度檢驗方法的驗證。2.目的 通過驗證確認所採用的方法適合於該藥品的微生物限度的測定 3.職責 專案責任人 負責驗證方案的起草及具體實施。驗證管理員 負責驗證工作的組織 協調及管理。qa現場監控員 負責驗證實施過程中的監督檢查，取樣，確保結果的可靠性。qc...
微生物限度檢驗方法驗證方案
1.2.2 白色念珠菌菌液製備 接種白色念珠菌的新鮮培養物至10ml改良馬丁培養基中，23 28 培養24 28小時 取此培養液1ml加0.9 無菌氯化鈉溶液9ml，採用10倍遞增稀釋法稀釋至10 6 10 7，製成每1ml含菌數50 100cfu的孢子懸浮液。1.2.3 黑麴菌菌液製備 接種黑麴菌...