微生物限度檢查法標準操作規程

2022-07-23 14:54:03 字數 2738 閱讀 8147

營養瓊脂培養基用於細菌計數,玫瑰紅鈉瓊脂培養基用於黴菌及酵母菌計數。

8.2.2菌數測定陰性對照試驗。取供試驗用的稀釋液1ml,置無菌平皿中,注入培養基,凝固,倒置培養。每種計數用的培養基各製備2個平板,均不得有菌生長。

8.2.3培養和計數。

除另有規定外,細菌培養48小時,逐日點計菌落數,一般以48小時的菌落數報告;黴菌、酵母菌培養時間為72小時,逐日點計菌落數,一般以72時的菌落數報告;必要時,可適當延長培養時間至5~7天進行菌落計數並報告。菌落蔓延生長成片的平板不宜計數。

8.2.4點計菌落數後,計算各稀釋級供試液的平均菌落數,按菌數報告規則報告菌數。若同稀釋級兩個平板的菌落數不小於15,則兩個平板的菌落數不能相差1倍以上。

8.2.5菌數報告規則:

宜選取細菌、酵母菌平均菌落數在30~300之間的稀釋級,黴菌宜選取平均菌落數在30~100之間的稀釋級,作為菌數報告(取兩位有效數字)的依據。(1)當僅有1個稀釋級的菌落數符合上述規定,以該級的平均菌落數乘以稀釋倍數值報告菌數。

(2)當同時有2個稀釋級的菌落數符合上述規定時,按下式計算兩級比值。

若比值≤2時,以兩稀釋級的菌落數乘以稀釋倍數的均值報告菌數;若比值大於2但不超過5時,以低稀釋級的菌落數乘以稀釋倍數的均值報告菌數;當比值出現大於5,或高稀釋級的菌落數大於或等於低稀釋級的菌落數等異常情況時,應查明原因再行檢查,必要時,應進行方法的重新驗證。

(3)當各稀釋級的平均菌落數均小於30時,以最低稀釋級的平均菌落數乘以稀釋倍數的值報告菌數。

(4)如各稀釋級的平板均無菌落生長,或僅最低稀釋級的平板有菌落生長,但平均菌落小於1時,以<1乘以最低稀釋倍數的值報告菌數。

8.3控制菌檢查。

(1)檢查法。供試品的控制菌檢查應按已驗證的方法進行,增菌培養基的實際用量同控制菌檢查方法的驗證。

(2)陽性對照試驗。進行供試品的控制菌檢查時,應做陽性對照試驗。陽性對照試驗的加菌量為10~100cfu,方法同供試品的控制菌檢查。陽性對照試驗應檢出相應的控制菌。

(3)陰性對照試驗。取稀釋液10ml照相應的控制菌檢查法檢查,作為陰性對照。陰性對照應無菌生長。

8.3.1大腸埃希菌。

8.3.1.1取供試液10ml(相當於供試品1g、1ml、10cm2),直接或處理後接種至適量(不少於100ml)的膽鹽乳糖培養基中,培養18~24小時,必要時可延至48小時。

8.3.1.

2取上述培養物各0.2ml,接種至5mlmug培養基的試管內,培養,於5小時、24小時在366nm紫外線下觀察,同時用未接種的mug培養基作本底對照。若管內培養物呈現螢光,為mug陽性;不呈現螢光,為mug陰性。

觀察後,沿培養管的管壁加入數滴靛基質試液,液面呈玫瑰紅色,為靛基質陽性;呈試劑本色,為靛基質陰性。本底對照應為mug陰性和靛基質陰性。

8.3.1.

2如mug陽性、靛基質陽性,判供試品檢出大腸埃希菌;如mug陰性、靛基質陰性,判供試品未檢出大腸埃希菌;如mug陽性、靛基質陰性,或mug陰性、靛基質陽性,則應取膽鹽乳糖培養基的培養物劃線接種於曙紅亞甲藍瓊脂培養基或麥康凱瓊脂培養基的平板上,培養18~24小時。

8.3.1.

3若平板上無菌落生長、或生長的菌落與下表所列的菌落形態特徵不符,判供試品未檢出大腸埃希菌。若平板上生長的菌落與下表所列的菌落形態特徵相符或疑似,應進行分離、純化、染色鏡檢和適宜的生化試驗,確認是否為大腸埃希菌。

大腸埃希菌菌落形態特徵

9 結果判斷。

9.1細菌菌落數、黴菌菌落數、控制菌三項均符合該品種微生物限度項下的規定,應判為供試品符合規定;其中任何一項不符合該品種項下規定,應判供試品不符合規定。

9.2細菌菌落數、黴菌菌落數第一次測定超過該品種項下微生物限度規定時,應從同一批號樣品中隨機抽樣,獨立複試2次,以3次結果平均值報告。

9.,經複試2次,如3次結果平均值仍超過規定應判為供試品不符合規定。

9.4各類製劑檢出控制菌或其他致病菌時,按第一次檢出結果為準,不再抽樣複試,即應判該供試品不符合規定。

10 活蟎檢查法。

10.1裝置和材料:顯微鏡、放大鏡、解剖針、髮絲針、小毛筆、載玻片、蓋玻片、30%甘油水、培養皿或小搪瓷盤。

10.2檢查法。

10.2.1取供試品放在預先襯有潔淨黑紙的培養皿或小搪瓷盤中。

10.2.2先用肉眼觀察,有無疑似活蟎的白點或其它顏色的點狀物,再用5~10倍放大鏡或雙筒實體顯微鏡檢視,有蟎者,用解剖針或者髮絲針或小毛筆挑取活蟎放在滴有一滴甘油水的載玻片上,置顯微鏡下觀察。

10.2.3活蟎卵的檢驗方法:

蟎卵極小,一般在0.1mm以下,呈乳白色,橢圓形或卵圓形。須用10~20倍放大鏡或顯微鏡方可查見。

蟎卵常見於活蟎群的周圍,但在未檢出活蟎的樣品中,亦有檢出蟎卵者。一般在供試品中已經檢出活蟎,不再進行蟎卵的檢查,對可疑供試品,未檢出活蟎時,可注意檢查活蟎卵。

檢驗方法:可採用檢驗活蟎項下的直檢法或漂浮法檢查。凡用上述兩種方法檢查,如發現可疑蟎卵時,用髮絲針小心挑取。

取一塊凹形載玻片,在凹窩**滴入2滴甘油水,將挑取物放入甘油水中,置顯微鏡下檢查。為確證挑取物是否為活蟎卵,可將上述載玻片置培養皿中,加蓋,於22~30℃培養3~8天,每天上、下午定時用低倍顯微鏡觀察,如在甘油水液中孵出幼蟎,則判斷為檢出活蟎卵。

10.3供試品檢驗報告:

凡供試品按上述方法檢驗,發現活蟎者,應作檢出活蟎報告。

在供試品中未檢出活蟎,但檢出活滿卵時,可按檢出活蟎處理。

為保留陽性結果備查,可將檢出的蟎按下法處理儲存:將活蟎挑放在載玻片上預先滴有1滴75%乳酸溶液中,加上載玻片。手持載玻片,在酒精燈小火焰上來回移動,緩緩加熱片刻,使其適當透化,即可鏡檢。

鑑定後的蟎體,可取下放入70%酒精中儲存,或適當處理。

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