中國藥品檢驗標準操作規程2010版-微生物限度檢查法
一、細菌、黴菌和酵母菌計數
１ 簡述
細菌、黴菌和酵母菌計數是檢測非規定滅菌製劑及原、輔料受微生物汙染程度的方法。也是用於評價生產企業藥用原料、輔料、裝置、器具、工藝流程、環境和操作者的衛生狀況的重要手段和依據。
細菌、黴菌和酵母菌計數均採用平板菌落計數法，這是活菌計數的方法之一，也是目前國際上許多國家常用的一種方法。以在瓊脂平板上的細菌、黴菌和酵母菌形成乙個獨立可見的菌落為計數依據。該法測**果只反映在該規定條件下所生長的細菌（為一群嗜中溫、需氧和兼性厭氧菌）、黴菌和酵母菌的菌落數。
不包括對營養、氧氣、溫度、ph和其他因素有特殊要求的細菌、黴菌和酵母菌。
乙個細菌、黴菌和酵母菌的菌落均可由乙個或多個菌細胞生長繁殖而成。因此供試品中所測得的菌落數，實際為菌落形成單位數（colony forming unity，cfu），不應理解為細菌、黴菌、酵母菌個數。
2 裝置、儀器
2.1 裝置
2.1.1 潔淨實驗室
微生物限度檢查應有單獨的潔淨實驗室，每個潔淨實驗室應有獨立的淨化空氣系統。
2.1.1.1 結構和要求
潔淨實驗室應採光良好、避免潮濕、遠離廁所及汙染區。操作間與緩衝間之間應有樣品傳遞艙，出入操作間和緩衝間的門不應直對。潔淨實驗室內應六面光滑平整，能耐受清洗消毒。
牆壁與地面、天花板連線處應呈凹弧形，無縫隙，不留死角。操作間內不應安裝下水道。
潔淨實驗室內的照明燈應嵌裝在天花板內，室內光照應分布均勻，光照度不低於300lx。
2.1.1.2 溫度、濕度潔淨實驗室內的溫度應控制在18～26℃，相對濕度最好在40％～60％。
2.1.1.3 操作間
操作間應安裝空氣除菌過濾層流裝置。潔淨度不應低於10000級，區域性潔淨度為100級（或放置同等級淨化工作台）。操作間或淨化工作台的潔淨空氣應保持對環境形成正壓，不低於10pa，操作間與緩衝間也應保持相對正壓，不低於5pa。
操作台上備有藥物天平，乙醇燈，火柴，乙醇棉球，大、小橡皮乳頭等。
2.1.1.4 緩衝間緩衝間內應有洗手盆和無菌衣、帽、口罩、鞋套等。
2.1.1.5 潔淨級別及檢查方法
通常採用塵粒數及浮游菌數或沉降菌數測定法（參照《醫藥工業潔淨室》（區）懸浮粒子、浮游菌、和沉降菌的測試方法》的現行國家標準）進行潔淨度驗證。
不同潔淨級別的微粒、浮游菌和沉降菌標準見下表1。
表l –不同潔淨級別的微粒、浮游菌和沉降菌標準
潔淨級別
塵埃數＜＜m3
浮游菌（個）＜＜m3
沉降菌（個）＜＜
90mm？0.5h）
微粒直徑≥0.5μm
微粒直徑≥5μm
100級
le;3,500
le;0
le;5
le;1
10000級
le;350,000
le;2000
le;100
le;3
100000級
3,500,000
le;20,000
le;500
le;10
沉降菌數測定（ⅱ法）
潔淨實驗室操作台消毒擦拭處理後，先啟動層流淨化裝置30min，將備妥的營養瓊脂平板3個（經30～35℃預培養48h，證明無菌落生長）。以無菌方式（或經傳遞箱）移人操作間，置淨化臺左、中、右各1個，開蓋，暴露30min後將蓋蓋上。在30～35℃培養箱內倒置培養48h，取出檢查。
3個平板生長的平均菌落數不超過1個。
有條件的單位，同時應檢查潔淨操作間和淨化工作台上的浮游菌和微粒數。
操作問和淨化工作台要定期檢測其潔淨度，分別應達到10000級和100級。如菌落數或微粒數超標，應清洗過濾系統中的過濾設施，必要時予以更換。
2.1.1.6 在每次操作前、後用0.1％苯扎溴銨溶液或其他適宜消毒液擦拭操作台及可能汙染的死角，然後啟動層流淨化裝置。
2.1.2 陽性菌實驗室
涉及實驗室監控菌株的分離鑑定、樣品陽性菌株的分離分析、方法驗證試驗中的陽性菌操作等實驗活動，應在專門的陽性菌實驗室進行。除另有規定外，陽性菌實驗室應符合國家ⅱ級生物安全標準，陽性菌實驗室應配備生物安全櫃。陽性菌操作不得在供試品檢驗用潔淨實驗室內進行。
2.1.3 潔淨實驗室、陽性菌實驗室與洗刷、滅菌、消毒、培養及結果觀察的工作間等設施應相對集中，布局合理，避免汙染，便於管理。
2.2 儀器
2.2.1 恆溫培養箱（30～35℃）、生化培養箱（23～28℃）、微波爐、勻漿儀（3000～8000
r／min）或康氏振盪器、恆溫水浴、電熱乾燥箱（100～300℃）、電冰箱、離心機、離心管、微孔濾膜及薄膜過濾器、蒸汽滅菌器（使用時要進行滅菌效果檢查並應定期請有關部門檢定）。
菌落計數器、顯微鏡（40×～1500×）、電子天平或藥物天平（感量0.1g），ph計。
2.2.2 玻璃器皿
錐形瓶（250～300ml、500ml內裝玻璃珠若干）、培養皿（9cm）、量筒（100ml，500m1）、試管（18mm×180mm）及塞、吸管（1m1分度0.0l，10m1分度0.1）、注射器（20ml或30m1）、塗佈棒、注射針頭、載玻片、蓋玻片、玻璃消毒缸（帶蓋）、不鏽鋼桶（帶蓋）。
玻璃器皿用前應洗滌乾淨，吸管、量筒不掛水滴，無殘留抗菌物質。吸管口上端距0.5cm處塞入約2cm的適宜疏鬆棉花，置吸管筒內或牛皮紙袋中。
錐形瓶、量筒、試管均應加棉塞或矽膠塞，若用振盪器製備混懸液時，尚需用玻璃紙包裹瓶塞，以免振盪時供試液汙染瓶塞，再用牛皮紙包紮。玻璃器皿，均於160℃乾熱滅菌2h或高壓蒸汽121℃滅菌30min，烘乾備用。
2.2.3 用具
大、小橡皮乳頭（放於乾淨帶蓋的容器中，並應定期用70％～75％乙醇溶液浸泡）。無菌衣、帽、口罩、手套（洗淨後配套，用牛皮紙包嚴）滅菌，備用。也可用一次性無菌衣、帽、口罩、手套。
接種環（白銥金或鎳鉻合金，環徑4～5mm、長度6～10cm）、乙醇燈、乙醇棉球或碘伏棉球、滅菌剪刀或滅菌手術刀和滅菌鑷子、滅菌鋼錐、滅菌稱樣紙、不鏽鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆、白瓷盤、洗手盆、陶瓦蓋（12cm）、實驗記錄紙等。
3 試液、稀釋劑和試劑
3.1試液
3.1.1 0.1％苯扎溴銨溶液或其他適宜消毒液（供洗手、擦拭操作檯面用）。
3.1.2 5％石碳酸溶液（配好後裝入玻璃消毒缸內，供消毒帶菌吸管用）亦可選用其他適宜消毒液。
3.1.3 75％乙醇溶液。
3.1.4 碘酊或碘伏溶液。
3.2 稀釋劑和試劑
稀釋劑配製後，採用高壓蒸汽滅菌法滅菌。
3.2.1 0.9％無菌氯化鈉溶液（附件二3.1）。
3.2.2 ph7.0無菌氯化鈉?蛋白腖緩衝液（附件二3.5）。
3.2.3 無菌聚山梨酯80氯化鈉?蛋白腖緩衝液（附件二3.4）。
微生物限度檢查法應用指導原則
為更好應用微生物限度檢查法 附錄 j 特制定本指導原則。微生物限度檢查法可用於判斷非規定滅菌製劑及原料 輔料是否符合藥典的規定，也可用於指導製劑 原料 輔料的微生物質量標準的制定，及指導生產過程中間產品微生物質量的監控。本指導原則將對標準和方法中的特定內容及標準的應用做進一步的說明。1.微生物限度檢...
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中國藥典微生物限度檢查法
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