中國藥典微生物限度檢查法 - 概述
《中國藥典》2010版一部、二部、三部附錄的微生物限度檢查法內容無差別，故此文方法，以《中國藥典》2010版二部附錄ⅺj為例。
微生物限度檢查應在環境潔淨度10000 級下的區域性潔淨度100 級的單向流空氣區域內進行。檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止再汙染。單向流空氣區域、工作檯面及環境應定期按《醫藥工業潔淨室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標準進行潔淨度驗證。
供試品檢查時，如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑，應證明其有效性及對微生物無毒性。
除另有規定外，本檢查法中細菌及控制菌培養溫度為30℃～35℃；黴菌、酵母菌培養溫度為23℃～28℃。
檢驗結果以1g、1ml、10g、10ml、10c㎡ 為單位報告，特殊品種可以最小包裝單位報告。
注：《醫藥工業潔淨室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標準分為
gb/t16292-2010 醫藥工業潔淨室(區)懸浮粒子的測試方法
gb/t16293-2010 醫藥工業潔淨室(區)浮游菌的測試方法
gb/t16294-2010 醫藥工業潔淨室(區)沉降菌的測試方法
中國藥典微生物限度檢查法 - 檢驗量和供試液製備
檢驗量檢驗量即一次試驗所用的供試品量（g、ml或cm）。
除另有規定外，一般供試品的檢驗量為10g或10ml；膜劑為100cm；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。要求檢查沙門菌的供試品，其檢驗量應增加20g或20ml（其中10g或10ml用於陽性對照試驗）。
檢驗時,應從2個以上最小包裝單位中抽取供試品，膜劑還不得少於4片。
一般應隨機抽取不少於檢驗用星（兩個以上最小包裝單位）的3倍最供試品。
供試液的製備
根據供試品的理化特性與生物學特性，採取適宜的方法製備供試液。供試液製備若需加溫時，應均勻加熱，且溫度不應超過45℃。供試液從製備至加入檢驗用培養基，不得超過1小時。
除另有規定外，常用的供試液製備方法如下。
1.液體供試品
取供試品10ml，加ph7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液至100ml，混勻，作為l:10的供試液。
油劑可加入適量的無菌聚山梨酯80使供試品分散均勻。水溶性液體製劑也可用混合的供試品原液作為供試液。
2.固體、半固體或黏稠性供試品
取供試品10g，加ph7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液至100ml，用勻漿儀或其他適宜的方法，混勻，作為1:10的供試液。
必要時加適量的無菌聚山梨酯80，並置水浴中適當加溫使供試品分散均勻。
3.需用特殊方法製備供試液的供試品
（1）非水溶性供試品
方法1 取供試品5g（或5ml )，加至含溶化的（溫度不超過45℃）5g司盤80、3g單硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80無菌混合物的燒杯中，用無菌玻棒攪拌成團後，慢慢加人45 ℃的ph7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液至100ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1 : 20的供試液。
方法2 取供試品10g，加至含20ml無菌十四烷酸異丙酯（制法見附錄xii a無菌檢查法中供試品的無菌檢查項下）和無菌玻璃珠的適宜容器中．必要時可增加十四烷酸異丙酯的用量，充分振搖，使供試品溶解。然後加入45 ℃的ph7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液100ml，振搖5～10分鐘，萃取，靜置使油水明顯分層，取其水層作為l :
10的供試液。
（2）膜劑供試品
取供試品100cm，剪碎，加ph7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液100ml（必要時可增加稀釋液），浸泡，振搖，作為1:10的供試液。
（3）腸溶及結腸溶製劑供試品
取供試品10g，加ph6.8無菌磷酸鹽緩衝液（用於腸溶製劑）或ph7.6無菌磷酸鹽緩衝液（用於結腸溶製劑）至100ml，置45 ℃水浴中，振搖，使溶解，作為1 :10的供試液。
（4）氣霧劑、噴霧劑供試品
取規定量供試品，置冰凍室冷凍約1小時，取出，迅速消毒供試品開啟部位，用無菌鋼錐在該部位鑽一小孔，放至室溫，並輕輕轉動容器，使拋射劑緩緩全部發布。用無菌注射器吸出全部藥液，加至適量的ph7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液（若含非水溶性成分，加適覺的無菌聚山梨酯80）中，混勻，取相當於10g或10ml的供試品，再稀釋成1:
10的供試液。
（5）貼劑供試品
取規定量供試品，去掉貼劑的保護層，放置在無菌玻璃或塑料片上，貼上面朝上。用適宜的無菌多孔材料（如無菌紗布）覆蓋貼劑的貼上面，以避免貼劑貼上在一起。然後將其置於適宜體積並含有表面活性劑（如聚山梨酯80或卵磷脂）的稀釋劑中，用力振盪至少30分鐘，製成供試液。
貼劑也可採用其他適宜的方法製備成供試液。
（6）具抑菌活性的供試品
當供試品有抑菌活性時，採用下列方法進行處理，以消除供試液的抑菌活性，再依法檢查。常用的方法如下。
①培養基稀釋法取規定量的供試液，至較大量的培養基中，使單位體積內的供試品含量減少，至不含抑菌作用。測定細菌、黴菌及酵母菌的菌數時，取同稀釋級的供試液2ml，每1ml供試液可等量分注多個平皿，傾注瓊脂培養基，混勻，凝固，培養，計數。每1ml供試液所註的平皿中生長的菌落數之和即為1ml的菌落數，計算每1ml供試液的平均菌落數，按平皿法計數規則報告菌數；控制菌檢查時，可加大增菌培養基的用量。
②離心沉澱法取一定量的供試液，500轉/分鐘離心3分鐘，取全部上清液混合。用於細菌檢查。
③薄膜過濾法見細菌、黴菌及酵母菌計數項下的「薄膜過濾法」。
④中和法凡含汞、砷或防腐劑等具有抑菌作用的供試品，可用適宜的中和劑或滅活劑消除其抑菌成分。中和劑或滅活劑可加在所用的稀釋液或培養基中。
中國藥典微生物限度檢查法 - 細菌、黴菌及酵母菌計數
計數培養基的適用性檢查
細菌、黴菌及酵母菌計數用的培養基應進行培養基的適用性檢查，成品培養基、由脫水培養基或按處方配製的培養基均應檢查。
菌種試驗用菌株的傳代次數不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的冷凍乾燥菌種為第0代），並採用適宜的菌種保藏技術進行儲存，以保證試驗菌株的生物學特性。
大腸埃希菌（escherichia coli[cmcc ( b ) 44l02]
金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus）[ cmcc ( b ) 26003 ]
枯草芽抱桿菌（bacillus subtilis ) [ cmcc ( b ) 63501 ]
白色念珠菌（candida albicans）〔cmcc ( f ) 98001〕
黑麴黴（aspergillus niger) [ cmcc ( f ) 98003 ]
菌液製備
接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中或營養瓊脂培養基上，培養18～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中或改良馬丁瓊脂培養基上，培養24～48小時。上述培養物用0 . 9%無菌氯化鈉溶液製成每lml含菌數為50～100cfu的菌懸液。
接種黑麴黴的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基上，培養5～7天，加人3～5ml含0.05 % ( ml /ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。
然後，採用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05 % ( ml / ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液製成每lml含孢子數50～100cfu的孢子懸液。
菌液製備後若在室溫下放置，應在2小時內使用；若儲存在2～8 ℃，可在24小時內使用。黑麴黴孢子懸液可儲存在2～8 ℃，在驗證過的貯存期內使用。
適用性檢查
取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌各50～100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注營養瓊脂培養基，每株試驗菌平行製備2個平皿，混勻，凝固，置30～35 ℃培養48小時，計數；取白色念珠菌、黑麴黴各50～100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，每株試驗菌平行製備2個平皿，混勻，凝固，置23～28 ℃培養72小時，計數；取白色念珠菌50～100cfu，注入無菌平皿中，立即傾注酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基．平行製備2個平皿，混勻，凝固，置23～28 ℃培養72小時，計數。同時，用相應的對照培養基替代被檢培養基進行上述試驗。
結果判定
若被檢培養基上的菌落平均數不小於對照培養基上的菌落平均數的70 %，且菌落形態大小與對照培養基上的菌落一致，判該培養基的適用性檢查符合規定。
計數方法的驗證
當建立產品的微生物限度檢查法時，應進行細菌、黴菌及酵母菌計數方法的驗證，以確認所採用的方法適合於該產品的細菌、黴菌及酵母菌數的測定。若產品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時，計數方法應重新驗證。
驗證時，按供試液的製備和細菌、黴菌及酵母菌計數所規定的方法及下列要求進行。對各試驗菌的**率應逐一進行驗證。
菌種及菌液製備
同計數培養鑑的適用性檢查。
驗證方法
驗證試驗至少應進行3次獨立的平行試驗，並分別計算各試驗菌每次試驗的**率。
( l )試驗組平皿法計數時，取試驗可能用的最低稀釋級供試液lml和50～100cfu試驗菌，分別注人平皿中，立即傾注瓊脂培養基，每株試驗菌平行製備2個平皿，按平皿法測定其菌數。薄膜過濾法計數時，取規定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，在最後一次的沖洗液中加人50～100cfu試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數。
( 2 )菌液組測定所加的試驗菌數。
( 3 )供試品對照組取規定量供試液，按菌落計數方法測定供試品本底菌數。
( 4 )稀釋劑對照組若供試液製備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾等特殊處理時，應增加稀釋劑對照組，以考察供試液製備過程中微生物受影響的程度。試驗時，可用相應的稀釋液替代供試品，加入試驗菌，使最終菌濃度為每lml供試液含50～100cfu，按試驗組的供試液製備方法和菌落計數方法測定其菌數。
結果判斷
在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌數**率（稀釋劑對照組的平均菌落數占菌液組的平均菌落數的百分率）應均不低於70 %。若試驗組的菌數**率（試驗組的平均菌落數減去供試品對照組的平均菌落數的值佔菌液組的平均菌落數的百分率）均不低於70%，照該供試液製備方法和計數法測定供試品的細菌、黴菌及酵母菌數；若任一次試驗中試驗組的菌數**率低於70 %，應採用培養基稀釋法、離心沉澱法、薄膜過濾法、中和法（常見干擾物的中和劑或滅活方法見表1）等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，並重新進行方法驗證。
微生物限度檢查法
中國藥品檢驗標準操作規程2010版 微生物限度檢查法 一 細菌 黴菌和酵母菌計數 簡述 細菌 黴菌和酵母菌計數是檢測非規定滅菌製劑及原 輔料受微生物汙染程度的方法。也是用於評價生產企業藥用原料 輔料 裝置 器具 工藝流程 環境和操作者的衛生狀況的重要手段和依據。細菌 黴菌和酵母菌計數均採用平板菌落計...
微生物限度檢查法應用指導原則
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