1.適用範圍
本方案適用於本公司各品種微生物限度檢驗方法的驗證。
2.目的
通過驗證確認所採用的方法適合於該藥品的微生物限度的測定 。
3.職責
專案責任人：負責驗證方案的起草及具體實施。
驗證管理員：負責驗證工作的組織、協調及管理。
qa現場監控員：負責驗證實施過程中的監督檢查，取樣，確保結果的可靠性。
qc負責人：負責驗證方案中檢驗方法的審核及按照規定的取樣計畫對標準檢驗操作程式的準確執行，負責組織實施。
qc檢驗員：負責驗證方案的起草與參與實施，並對所測資料準確性負責。
質量部經理：負責驗證方案及報告的審核和批准。
4.內容
4.1.概述
通過驗證以確認所採用的方法適合於該藥品的細菌、黴菌及酵母菌的測定；確認所採用的方法適合於該藥品的控制菌的檢查。根據樣品特性制訂檢驗方法和檢驗條件，按制定的方法進行試驗，根據驗證結果判斷是否符合驗證標準。若符合，按驗證的方法和條件進行藥品的微生物限度檢查；若不符合，重新建立制訂檢驗方法和檢驗條件，再進行驗證，直至驗證結果符合設立的驗證標準。
4.2細菌、黴菌及酵母菌計數方法的驗證
當建立藥品的微生物限度檢查時，應進行細菌、黴菌及酵母菌計數方法的驗證，以確認所採用的方法適合於該藥品的細菌、黴菌及酵母菌的測定。驗證試驗可與供試品的細菌、黴菌及酵母菌計數同時進行。
4.2.1.驗證用菌株及菌種要求
大腸埃希菌【cmcc（b）44102】
金黃色葡萄球菌【cmcc（b）26003】
枯草芽孢桿菌【cmcc（b）63501】
黑麴黴【cmcc（f）98003】
白色念珠菌【cmcc（f）98001】。
大腸埃希菌為革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，枯草芽孢桿菌為產芽孢桿菌，前述菌株作為細菌計數驗證用菌株；黑麴黴為黴菌，白色念珠菌為酵母菌，作為黴菌及酵母菌計數驗證用菌株。
驗證實驗所用的菌株傳代次數不得超過5代 （從菌種儲存中心獲得的冷凍乾燥菌種為0 代），並採用適宜的菌種保藏技術，以保證試驗菌株的生物學特性。
4.2.2.驗證菌菌液製備
4.2.2.
1. 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液製備：接種大腸埃希菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至10ml營養瓊脂培養基中，35～37℃ 培養18～24小時。
取此培養液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，採用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-6~10-7，製成每1ml含菌數 50～100cfu的菌懸液。
4.2.2.
2.白色念珠菌菌液製備：接種白色念珠菌的新鮮培養物至10ml改良馬丁培養基中，23～28℃培養 24～48小時；取此培養液1ml加0.
9%無菌氯化鈉溶液9ml，採用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-6~10-7，製成每1ml含菌數 50～100cfu的菌懸液。
4.2.2.
3.接種黑麴黴的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基中，23～28℃培養5～7天，加入3～5ml 0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫，吸至無菌試管內，取1ml加0.
9%無菌氯化鈉溶液9ml，採用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-4~10-6，製成每1ml含孢子數50～100cfu的孢子懸液。
4.2.3. 供試液的製備
4.2.3.1.無抑菌活性的供試品供試液的製備
◆稀釋劑：ph7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液
◆液體供試品：供試品10ml置錐形瓶中，加入90ml稀釋劑，混勻，作為供試液（1：10）。
◆固體、半固體、粘稠性供試品供試品： 稱取供試品10g置錐形瓶中，加稀釋劑至100ml，混勻後，作為供試液（1：10）。
4.2.3.2.具有抑菌活性的供試品供試液的製備
當供試品具有抑菌活性時，須先消除抑菌活性，其方法如下：
◆ 培養基稀釋法：取供試液2ml，每0.2ml的供試液註一皿或每0.
1ml的供試液註一皿；或取供試液1ml每0.5ml的供試液註一皿，傾注15ml的培養基，測定細菌、黴菌及酵母菌的菌數，混勻，凝固，培養。每1ml供試液所註的平皿生長的菌數之和即為1ml的菌落數。
計算每1ml供試液的平均菌落數， 按平皿法計數規則報告菌數；控制菌檢查時可加大增菌液的用量。
◆離心沉澱集菌法：取一定量的供試液，3000轉/分離心20分鐘（供試液如有沉澱，先以500轉/分鐘離心5分鐘，取全部上清液再離心），棄去上清液，留底部集菌液約2ml，加稀釋液補至原量。
◆薄膜過濾法：取規定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，按薄膜過濾法測定其菌落數。
◆ 中和法：選取適宜的中和劑如磺胺類藥物加入適當的對氨基苯甲酸，含重金屬的藥物在培養基內加入巰基化合物如硫乙醇酸鈉-半胱氨酸，洗必泰製劑加入聚山梨酸 80（3%）或卵磷脂（3%），鹵素中加入硫代硫酸鈉（0.1%）等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性後測定。
4.2.4.
菌液組測定所加的試驗菌數。採用平皿法，取試驗用的1ml菌液（約50～100cfu）分別注入平皿中，立即傾入培養基，每株試驗菌平行製備2個平皿，按平皿法測定其菌落數。
4.2.5.試驗組
4.2.5.
1.平皿法：取試驗可能用的最低稀釋級1ml供試液和50～100cfu試驗菌，分別注入平皿中，立即傾入培養基，每株試驗菌平行製備2個平皿，按平皿法測定其菌落數。
4.2.5.
2.培養基稀釋法（平皿法）：取試驗可能用的最低稀釋級1ml供試液分別注入n個平皿中，每個平皿再注入50～100cfu試驗菌，分別注入平皿中，立即傾入培養基，每株試驗菌平行製備2個平皿，按平皿法測定其菌落數。
4.2.5.
3薄膜過濾法：取規定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，在最後一次的沖洗液中加入50～100cfu試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌落數。至少要一張膜。
4.2.5.
4. 離心沉澱集菌法：取規定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，如供試液含許多藥渣，先以500轉/分鐘離心3~5分鐘，取全部上清液，再以3000轉/分離心 20分鐘，取下面1ml液體，並用稀釋劑洗滌管底，將洗滌液與1ml液體一起採用平皿法或薄膜過濾法計數。
4.2.6. 供試品對照組
取規定量供試液，按菌落計數方法測定供試品本底菌數（方法和試驗組相同）。
4.2.7.稀釋劑對照組
若供試液需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾法等處理時，應增加稀釋劑對照組，用稀釋劑代替供試品，加入試驗菌，使最終濃度為每1ml 供試液含50～100cfu，按試驗組的供試液製備方法和計數方法計數。
4.2.8.**率計算
4.2.8.1.試驗組**率計算
試驗組的菌**率＝ 試驗組的菌**率—供試品對照組平均菌落數 ×100%
菌液組的平均菌落數
4.2.8.2. 稀釋劑對照組**率計算
試驗組的菌**率＝ 稀釋劑對照組平均菌落數 ×100%
菌液組的平均菌落數
計數方法驗證至少應進行3次獨立平行試驗，並分別計算各試驗菌每次試驗的**率。
4.2.8.結果判斷
在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌**率（稀釋劑對照組的平均菌落數占菌液組的平均菌落數的百分率）≥70%。若試驗組的菌**率（試驗組的平均菌落數減去供試品對照組的平均菌落數占菌液組的平均菌落數的百分率）≥70%。照該供試液製備方法和計數法測定供試品的細菌、黴菌及酵母菌數；若任一次試驗中試驗組的菌**率低於70%，應採用自然沉降法、培養基稀釋法、離心沉澱集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，並重新進行方法驗證，使試驗組菌**率大於70%。
4.3. 控制菌檢驗方法驗證
當建立藥品的微生物限度檢查時，應進行控制菌檢查方法的驗證，以確認所採用的方法適合於該藥品的的控制菌檢查方法測定。若藥品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時，檢驗方法應進行重新驗證。驗證試驗也可與供試品的控制菌檢查同時進行。
4.3.1.驗證用菌株
大腸埃希菌（esherichia coli）【cmcc(b) 44102】、金黃色葡萄球菌（ staphylococcus）【cmcc(b)26003】、乙型付傷寒沙門菌（salmonella paratyphi b）【cmcc(b) 50094】、銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa）【cmcc (b) 10104】
驗證實驗所用的菌株傳代次數不得超過5代 （從菌種儲存中心獲得的冷凍乾燥菌種為0 代），並採用適宜的菌種保藏技術，以保證試驗菌株的生物學特性。
4.3.2.菌液製備
大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型付傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養物至10ml營養肉湯培養基中，35～37℃培養18～24小時；分別取培養液 1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液，採用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5~10-7，製成每1ml含菌數10～100cfu的菌懸液。
4.3.3.
陰性菌對照組設立陰性菌對照組是為了驗證該控制菌檢查方法的專屬性。方法同試驗組，驗證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時的陰性對照菌採用金黃色葡萄球菌；驗證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌檢查法時的陰性對照菌採用大腸埃希菌。陰性對照菌不得檢出。
4.3.4.試驗組
4.3.4.1.常規法
◆ 大腸埃希菌取相當於1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養基中，陽性菌對照加入大腸埃希菌10～100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌 10～100cfu，35～37℃培養18～24小時，取此培養物按《微生物限度檢查sop》大腸埃希菌項下規定檢查。
◆大腸菌群取含適量（不少於10ml）的膽鹽乳糖發酵培養基管3支，分別加入含供試品1g或1ml 、0.1g或0.1ml、含供試品0.
001g或0.001ml的供試液，陽性菌對照加入大腸埃希菌10～100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌 10～100cfu，35～37℃培養18～24小時，按《微生物限度檢查sop》大腸菌群項下規定檢查。
◆沙門菌取供試品10g或10ml，直接或處理後接種至適量（不少於200ml）的營養肉湯培養基中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻，陽性菌對照加入沙門菌 10～100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培養18～24小時。按《微生物限度檢查sop》沙門菌項下規定檢查。
微生物限度檢驗方法驗證方案
1.2.2 白色念珠菌菌液製備 接種白色念珠菌的新鮮培養物至10ml改良馬丁培養基中，23 28 培養24 28小時 取此培養液1ml加0.9 無菌氯化鈉溶液9ml，採用10倍遞增稀釋法稀釋至10 6 10 7，製成每1ml含菌數50 100cfu的孢子懸浮液。1.2.3 黑麴菌菌液製備 接種黑麴菌...
藥品微生物限度檢查方法驗證試驗
吉林九鑫藥業 檢驗原始記錄 1 檢品名稱 更年寧檢品批號 20111001 2 驗證依據 中國藥典2010年版 微生物限度檢查方法驗證試驗 3 儀器 4 培養基 5 細菌 黴菌及酵母菌計數方法的驗證 5.1 驗證用菌種 大腸埃希菌枯草芽孢桿菌金黃色葡萄球菌白色念球菌黑曲黴菌 巿藥檢所 5 2菌液製備...
藥品微生物限度檢測方法驗證報告
阿莫 微生物限度檢測方法驗證報告摘要通過此次驗證證明薄膜過濾法可用於含抑菌成分的阿莫 微生物限度菌數的檢驗，提高抗菌藥物的檢出率和 率。阿莫 微生物限度檢查法係指非規定滅菌製劑及其原 輔料受到微生物汙染程度的一種檢測方法，包括染菌量及控制菌的檢查。微生物限度檢查應在環境潔淨度10000級下的區域性潔...