1.2.2 白色念珠菌菌液製備：
接種白色念珠菌的新鮮培養物至10ml改良馬丁培養基中，23～28℃培養24～28小時；取此培養液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，採用10倍遞增稀釋法稀釋至10-6～10-7，製成每1ml含菌數50～100cfu的孢子懸浮液。
1.2.3 黑麴菌菌液製備：
接種黑麴菌的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基中，23～28℃培養5～7天，加入3～5ml0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸至無菌試管中，取1ml加無菌氯化鈉溶液9ml，採用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-4～10-6，製成每1ml含數50～100cfu的孢子懸液。
1.3 供試液的製備
1.3.1 無抑菌活性的供試品供試液的製備
1.3.1.1 稀釋劑：ph7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液
1.3.1.2 液體供試品：供試品10ml置錐形瓶中，加90ml稀釋劑，混勻，作為供試液 （1：10）。
1.3.1.3 固體、半固體、粘稠性供試品：稱取供試品10g置錐形瓶中，加稀釋劑至100ml，混勻後，作為供試液（1：10）。
1.3.2 具有抑菌活性的供試品試液的製備
1.3.2.1 當供試品具有抑菌活性時，須先消除抑菌活性，其方法如下：
1.3.2.
1 培養基稀釋法：取供試液2ml，沒0.2ml的供試液註一皿或每0.
1ml的供試液註一皿；或取供試液1ml每0.5ml的供試液註一皿，傾注15ml的培養基，測定細菌、黴菌及酵母菌的菌數，混勻，凝固，培養。每1ml供試液所註的平皿生長的菌數之和即為1ml的菌落數。
計算每1ml供試液的平均菌落數，按平皿法技術規則報告菌數。控制菌檢查時可加大增菌液的用量。
1.3.2.
2 離心沉澱集菌法：取一定量的供試液，3000轉/分離心20分鐘（供試液如有沉澱，先以500轉/分離心5分鐘，取全部上清液再離心），棄去上清液，留底部集菌液約2ml，加稀釋液補至原量。
1.3.2.3 薄膜過濾法：取規定量試驗可能用的最低稀釋劑供試液，過濾，沖洗嗎，按薄膜過濾法測定其菌落數。
1.3.2.4 中和法：選取適宜的中和劑消除供試品的抑菌活性後測定。
1.4 菌液組：測定所加的試驗菌數。採用平皿法，取試驗用的1ml菌液（約50～100cfu）分別注入平皿中，立即傾入培養基，每株試驗菌平行製備2個平皿，按平皿法測定其菌落數。
1.5 試驗組
1.5.1 平皿法：取試驗可能用的最低稀釋級1ml供試液和50～100cfu試驗菌，分別注入平皿中，立即傾入培養基，每株試驗菌平行製備2個平皿，按平皿法測定其菌落數。
1.5.2培養基稀釋法（平皿法）：
取試驗可能用的最低稀釋級1ml供試液分別注入n個平皿中，每個平皿再注入50～100cfu試驗菌，分別注入平皿中，立即傾入培養基，每株試驗菌平均製備2個平皿，按平皿法測定其菌落數。
1.5.3 薄膜過濾法：取規定量試驗可能用的最低階供試液，過濾，沖洗，在最後一次的沖洗液中加入50～100cfu試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌落數。至少要一張膜。
1.5.4 離心沉澱集菌法：
取規定量試驗可能用的最低稀釋劑供試液，如供試液含許多藥渣，先以500轉/分鐘離心3～5分鐘，取全部上清液，再以3000轉/分離心20分鐘，取下面1ml液體，並用稀釋劑洗地管底，將洗滌液與1ml液體一起採用平皿法或薄膜過濾法計數。
1.6 供試品對照組
取規定量供試液，按菌落計數方法測定供試品本底菌數（方法和試驗組相同）。
1.7 稀釋劑對照組
若供試劑需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾法額、等處理時，應增加稀釋劑對照組。用稀釋劑代替供試品，加入試驗菌。最終濃度為每1ml供試液含50～100cfu，按試驗組的供試液製備方法和技術方法計算。
1.8 **率計算
1.8.1 試驗組**率計算
試驗組的菌**率=×100%
1.8.2 稀釋劑對照組**率計算
試驗組的菌**率=×100%
計數方法驗證至少應進行3次獨立平行試驗，並分別計算各試驗菌每次試驗的**率。
1.9. 在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌**率（稀釋劑對照組的平均菌落數減去供試品對照組的平均菌落數占菌液組的品均菌落數的百分率）≥70%，應採用自然沉降法、培養基稀釋法、離心沉澱集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，並重新進行方法驗證，是試驗組菌**率大於70%。
2. 控制菌檢驗方法與驗證
當建立藥品的微生物限度檢查時，應進行控制菌檢查方法的驗證，以確認所採用的方法適合於該藥品的控制菌檢查方法測定。若藥品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時，檢驗方法應進行重新驗證。驗證試驗也可與供試品的控制菌檢查同時進行。
2.1 驗證用菌株
大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型付傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌為驗證用菌株，菌株傳代次數不得超過5代。
2.2 菌液製備
大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型付傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養物至10ml營養肉湯培養基中，35～37℃培養18～24小時；分別取培養液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液，採用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5～10-7，製成每1ml含菌數10～100cfu的菌懸液。
2.3 陰性菌對照組
設立陰性菌對照組是為了驗證該控制菌檢查方法的專屬性。方法同試驗組，驗證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時的陰性對照菌採用金黃色葡萄球菌；驗證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌檢查方法時的陰性對照菌採用大腸埃希菌。陰性對照菌不得檢出。
2.4 試驗組
2.4.1 常規法
2.4.1.
1 大腸埃希菌：取相當於1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養基中，陽性菌對照組加入大腸埃希菌10～100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培養18～24小時，取此培養物按《微生物限度檢測標準操作規程》大腸埃希菌項下規定檢查。
2.4.1.
2 大腸菌群：取含適量（不少於10ml）的膽鹽乳酸發酵培養基管3支，分別加入含供試品1g或1ml、0.1g或0.
1ml、含供試品0.001g或0.001ml的供試液，陽性菌對照加入大腸埃希菌10～100cfu，陰性菌對照計入近換色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培養18～24小時，按《微生物限度檢測標準操作規程》大腸菌群項下規定檢查。
2.4.1.
3 沙門菌：取供試品10g或10ml，直接或處理後接種至適量（不少於200ml）的營養肉湯培養基中，用均漿儀或其他適宜方法混勻，陽性菌對照加沙門菌10～100cfu，陰性菌對照加入近換色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培養18～24小時。按《微生物限度檢測標準操作規程》沙門菌項下規定檢查。
2.4.1.
4 銅綠假單胞菌：取相當於1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養基中，陽性菌對照加入銅綠假單胞菌10～100cfu，陰性菌對照加入大腸埃希菌10～100cfu35～37℃培養18～24小時。按《微生物限度檢測標準操作規程》沙門菌項下規定檢查。
2.4.1.
5 金黃色葡萄球菌：取相當於1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養基中，陽性菌對照加入銅綠假單胞菌10～100cfu，陰性菌對照加入大腸埃希菌10～100cfu35～37℃培養18～24小時。按《微生物限度檢測標準操作規程》金黃色葡萄球菌項下規定檢查。
2.4.2 培養基稀釋法：
供試品有抑菌作用，放大培養基量由1：100放大到1：300、1：
500或1：1000，由於容器提及限制，一般放大到500ml或1000ml，本法適用於抑菌作用不簽的樣品。
2.4.3 薄膜過濾法：
採用薄膜過濾法時，取規定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應加在最後一次沖洗液中，取全部上清液，再以3000轉/分離心20分鐘取下面液體，並將適量的稀釋劑洗滌管底的洗滌液一併移入同瓶增菌液中，培養，本法適用於中等抑菌作用的樣品。
2.4.4 中和法：在供試品溶液中加入相應的中和劑一減除供試品中抑菌成份的作用，中和劑應對微生物無毒性，與抑菌成份結合後的產物應對微生物無毒性，或有毒性但不影響待檢菌的檢出。
2.5 結果判斷
至少進行3次獨立平行試驗。陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌。若試驗組檢出試驗菌，按照該供試液製備方法和控制菌檢查法進行該供試品控制菌的檢查；若試驗組未檢出試驗菌，應採用自然沉降法、培養基稀釋法、離心沉澱集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，並重新進行方法驗證。
3. 驗證的實施
3.1 細菌、黴菌、酵母菌計數方法驗證記錄及控制菌檢驗方法驗證記錄（見附錄）。
3.2分析資料，綜合整個驗證過程，得出驗證結論。
3.3 驗證過程中發生的異常情況，按照《偏差處理程式》進行處理。
4. 在驗證
4.1 驗證時的檢驗條件愛你發生改變可能影響檢驗結果時。
5. 附錄
《微生物限度檢測標準操作規程》
微生物限度檢驗方法驗證方案
1.適用範圍 本方案適用於本公司各品種微生物限度檢驗方法的驗證。2.目的 通過驗證確認所採用的方法適合於該藥品的微生物限度的測定 3.職責 專案責任人 負責驗證方案的起草及具體實施。驗證管理員 負責驗證工作的組織 協調及管理。qa現場監控員 負責驗證實施過程中的監督檢查，取樣，確保結果的可靠性。qc...
藥品微生物限度檢查方法驗證試驗
吉林九鑫藥業 檢驗原始記錄 1 檢品名稱 更年寧檢品批號 20111001 2 驗證依據 中國藥典2010年版 微生物限度檢查方法驗證試驗 3 儀器 4 培養基 5 細菌 黴菌及酵母菌計數方法的驗證 5.1 驗證用菌種 大腸埃希菌枯草芽孢桿菌金黃色葡萄球菌白色念球菌黑曲黴菌 巿藥檢所 5 2菌液製備...
藥品微生物限度檢測方法驗證報告
阿莫 微生物限度檢測方法驗證報告摘要通過此次驗證證明薄膜過濾法可用於含抑菌成分的阿莫 微生物限度菌數的檢驗，提高抗菌藥物的檢出率和 率。阿莫 微生物限度檢查法係指非規定滅菌製劑及其原 輔料受到微生物汙染程度的一種檢測方法，包括染菌量及控制菌的檢查。微生物限度檢查應在環境潔淨度10000級下的區域性潔...