植物總DNA的提取

2023-01-06 14:09:05 字數 1103 閱讀 8021

採用常規ctab法抽提植物基因組dna,步驟如下:

1) 取約0.3 g植物葉片,在液氮中研磨成粉末;

2) 迅速將粉末轉移到2 ml的離心管中,加入4倍體積(w/v)預熱的ctab提取緩衝液(含2%β-巰基乙醇),溫和混勻;

3) 65℃保溫30-60 min,期間不時搖動,使其充分混勻;

4) 12,000 rpm離心5 min,**上清液;

5) 用等體積的25 : 24 : 1酚/氯仿/異戊醇抽提勻漿液,顛倒使充分混合,於4℃5,000 rpm離心10 min,**水(上)相;

6) 用等體積的24 : 1氯仿/異戊醇抽提,混勻,離心,**水(上)相;

7) 取上清,加入0.7倍體積預冷的異丙醇,混勻,-20℃放置20 min;

8) 12,000 rpm離心10 min小心棄除上清液;

9) 加入適量75%乙醇洗滌沉澱(共洗滌2次);

10) 自然風乾(或37℃烘乾),加入適量te溶解,-20℃儲存備用;

11) 取2 l dna樣品在0.8% 瓊脂糖凝膠上電泳,檢測dna的分子大小。同時取2 l稀釋50倍,測定od260/od280,檢測dna含量及質量。

剩餘的-20℃貯存備用。

由於雜草中含有較多的多醣多酚等抑制物質,因此pcr反應前,取50 μl總核酸用購自tiangen公司的pcr產物純化試劑盒進行純化,以提高檢出率。具體的操作步驟如下:

1) 柱平衡步驟:向吸附柱cb2中加入500 μl的平衡液bl,12,000 rpm離心1 min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放**集管中;

2) 向50 μl dna溶液中加入150 μl的溶液pc,充分吹打混勻;

4) 向吸附柱中加600 μl漂洗液pc,靜置5 min後12,000 rpm離心1 min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放**集管中;

5) 再次加入600 μl漂洗液pc洗柱,12,000 rpm離心1 min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放**集管中;

6) 12,000 rpm離心2 min去除壁上的液體,然後將cb2轉移到無菌的1.5 ml離心管中,靜置數分鐘徹底晾乾;

7) 向吸附管內加入50 l洗脫液eb、水或te溶液,並於室溫靜置2 min,並於12,000 rpm離心1 min收集dna溶液。

CTAB提取植物DNA步驟

一 將冷凍乾燥的樣品用液氮研磨成粉末,轉移到離心管,加入65 預熱的2ml ctab抽提液,65 保溫30 min 以上,間或輕搖混勻 12 000 r min室溫離心10 min,取上清液 二 加入等體積的苯酚 氯仿 異戊醇 25 24 1 輕輕混勻15 min以上,12 000 r min室溫離...

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