採用常規ctab法抽提植物基因組dna,步驟如下:
1) 取約0.3 g植物葉片,在液氮中研磨成粉末;
2) 迅速將粉末轉移到2 ml的離心管中,加入4倍體積(w/v)預熱的ctab提取緩衝液(含2%β-巰基乙醇),溫和混勻;
3) 65℃保溫30-60 min,期間不時搖動,使其充分混勻;
4) 12,000 rpm離心5 min,**上清液;
5) 用等體積的25 : 24 : 1酚/氯仿/異戊醇抽提勻漿液,顛倒使充分混合,於4℃5,000 rpm離心10 min,**水(上)相;
6) 用等體積的24 : 1氯仿/異戊醇抽提,混勻,離心,**水(上)相;
7) 取上清,加入0.7倍體積預冷的異丙醇,混勻,-20℃放置20 min;
8) 12,000 rpm離心10 min小心棄除上清液;
9) 加入適量75%乙醇洗滌沉澱(共洗滌2次);
10) 自然風乾(或37℃烘乾),加入適量te溶解,-20℃儲存備用;
11) 取2 l dna樣品在0.8% 瓊脂糖凝膠上電泳,檢測dna的分子大小。同時取2 l稀釋50倍,測定od260/od280,檢測dna含量及質量。
剩餘的-20℃貯存備用。
由於雜草中含有較多的多醣多酚等抑制物質,因此pcr反應前,取50 μl總核酸用購自tiangen公司的pcr產物純化試劑盒進行純化,以提高檢出率。具體的操作步驟如下:
1) 柱平衡步驟:向吸附柱cb2中加入500 μl的平衡液bl,12,000 rpm離心1 min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放**集管中;
2) 向50 μl dna溶液中加入150 μl的溶液pc,充分吹打混勻;
4) 向吸附柱中加600 μl漂洗液pc,靜置5 min後12,000 rpm離心1 min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放**集管中;
5) 再次加入600 μl漂洗液pc洗柱,12,000 rpm離心1 min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放**集管中;
6) 12,000 rpm離心2 min去除壁上的液體,然後將cb2轉移到無菌的1.5 ml離心管中,靜置數分鐘徹底晾乾;
7) 向吸附管內加入50 l洗脫液eb、水或te溶液,並於室溫靜置2 min,並於12,000 rpm離心1 min收集dna溶液。
CTAB提取植物DNA步驟
一 將冷凍乾燥的樣品用液氮研磨成粉末,轉移到離心管,加入65 預熱的2ml ctab抽提液,65 保溫30 min 以上,間或輕搖混勻 12 000 r min室溫離心10 min,取上清液 二 加入等體積的苯酚 氯仿 異戊醇 25 24 1 輕輕混勻15 min以上,12 000 r min室溫離...
植物基因組DNA提取試劑盒 北京天根
1 取植物新鮮組織約100 mg或乾重組織約30 mg,加入液氮充分研磨。2 將研磨好的粉末迅速轉移到預先裝有700 l 65 預熱緩衝液gp1的離心管中 實驗前在預熱的gp1中加入巰基乙醇,使其終濃度為0.1 迅速顛倒混勻後,將離心管放在65 水浴20 min,水浴過程中顛倒離心管以混合樣品數次。...
2019質粒DNA的轉化和提取
質粒dna的轉化 1 lb平板 將滅菌後的固體培養基 加入了抗生素 倒入90 mm的培養皿中 約10 ml 氨卞青黴素 amp 儲存液濃度50 mg ml 工作濃度為60 g ml 卡那 kan 儲存液濃度50 mg ml 工作濃度為25 g ml 四環素 tet 儲存液濃度5 mg ml 工作濃度...