一實驗目的
通過本實驗學習掌握鹼裂解法提取細菌質粒dna。
二實驗原理
1. 細菌中有兩種dna，即染色體dna和質粒dna。
2. 質粒dna的提取方法有三種：鹼裂解法，煮沸法，去汙劑（如triton和sds）裂解法。
3. 鹼裂解法比較劇烈，可破壞鹼基配對，使宿主細胞dna變性，共價閉合環狀dna由於空間纏繞，兩條鏈不會徹底分開。當外界條件到達復性條件時，質粒dna的雙鏈又迅速恢復原狀，而較大的線性染色體dna難以復性。
三實驗材料：轉化後的細菌(含有質粒的大腸桿菌)
四、實驗用具和藥品
1. 實驗用具:
搖床，離心機，移液器及槍頭，玻璃試管（15ml）及塞子，離心管（1.5ml）
2. 實驗試劑：
（1）溶液i
50 mmol/l 葡萄糖
25 mmol/l 三羥甲基氨基甲烷（tris）tris·hcl（ph8.0）
10 mmol/l 乙二胺四乙酸（edta）（ph8.0）
（2）溶液ii
0.4mol/l naoh，2%sds，用前等體積混合
（3）溶液iii 5 mol/l 乙酸鉀 60ml
冰乙酸11.5ml
水28.5ml
（4）te 緩衝液
10 mmol/l tris·hcl（ph8.0）
1 mmol/l edta（ph8.0）
（5）70%乙醇（放-20℃冰箱中，用後即放回）
（6）加樣緩衝液（6x）：40%蔗糖、0.25%溴酚蘭
（7）電泳緩衝液：0.045mol/l tris-硼酸 0.001mol/l edta （0.5x tbe buffer）
電泳緩衝液貯存液：5x：54g tris鹼、27.5g硼酸、20ml 0.5mol/l edta（ph8.0）
五實驗步驟
（一）細菌繁殖
挑取白色的單菌落若干，轉移到3ml液體lb培養基(附加100mg/ml amp ),37℃過夜振盪（200r/min）培養。
（二）菌體收集
將過夜培養的菌體轉入1.5ml離心管，離心30sec 5000r/min；棄上清提取質粒
（三）質粒提取
方法一：鹼裂解法提取質粒dna
1．.將上述沉澱重懸於250μl冰預冷的溶液ⅰ中，劇烈**；
2．加入250μl溶液ⅱ，蓋緊管口，快速顛倒離心管5~10次；
3．加入350μl冰預冷的溶液ⅲ，蓋緊管口，溫和地顛倒離心管5~10次；9000r/min離心5min上清轉移到另一新1.5ml離心管中；
4．加等體積氯仿，振盪混合，靜置， 9000r/min離心5min，上清轉移到另一新1.5ml離心管中；
5．加入1/10體積3mol/l的醋酸鈉和2倍體積的乙醇，充分混勻，靜置5min；9000r/min離心5min；
6．棄上清，用70％ethanol洗滌；
7．加30μlte溶解，-20 ℃儲存。
方法二：試劑盒提取方法
1.離心收集的菌體中加入含rnaase的溶液ⅰ250μl，重懸菌體，不應留有小的菌塊；
2. 加溶液ⅱ250μl，輕輕顛倒離心管4-6 次，使菌體充**解，至溶液澄清；
3. 加入350μl冰預冷的溶液ⅲ，溫和並充分地上下翻轉混合6-8 次；
4. 12000r/min離心10min；
5. 將上清轉移到dna結合管（置於2 ml 離心管中），12000r/min離心1min，棄濾液；
6. 將製備管置回離心管，加入去蛋白試劑500μl，12000r/min離心1min，棄濾液；
7. 將製備管置回離心管，加洗滌液700μl，12000r/min離心1min，棄濾液；以同樣的方法再用700μl洗滌液洗滌一次，棄濾液。
8. 將製備管置回2 ml 離心管中，12,000×g 離心1 min，去除殘餘的洗滌液；
10 將dna結合柱放入另乙個新的1.5ml離心管中，在製備管膜**加60-80μl洗脫液或去離子水，室溫靜置1 min。12,000×g 離心1 min。
（四）檢測提取dna質量的電泳檢測。
● 取4ul質粒dna+2ul加樣緩衝液+6ul ddh2o；
● 配製1%的瓊脂糖凝膠
● 電泳30min，eb染色，拍照。
注意事項：氯仿對眼睛、**、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌劑並可損傷肝臟和腎臟，操作時需戴手套、口罩。
六實驗作業
1. 思考本實驗的關鍵步驟是什麼？
2. 瓊脂糖電泳鑑定質粒dna時，能看到幾條帶，快慢順序是什麼？
2019質粒DNA的轉化和提取
質粒dna的轉化 1 lb平板 將滅菌後的固體培養基 加入了抗生素 倒入90 mm的培養皿中 約10 ml 氨卞青黴素 amp 儲存液濃度50 mg ml 工作濃度為60 g ml 卡那 kan 儲存液濃度50 mg ml 工作濃度為25 g ml 四環素 tet 儲存液濃度5 mg ml 工作濃度...
質粒DNA的提取 定量 酶切與PCR鑑定實驗報告
一 實驗目的 1.學習並掌握用鹼裂解法提取質粒dna的方法 2.學習並掌握了解質粒酶切鑑定的方法 3.學習並掌握紫外吸收檢測dna濃度和純度的原理和方法 4.學習並掌握pcr基因擴增的實驗原理和操作方法 5.學習並掌握水平式瓊脂糖凝膠電泳的原理和使用方法。二 實驗原理 1.pcr 多聚酶鏈式反應 在...
瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA
agarose gel electrophoresis 目的和要求 學習和掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理和基本操作 實驗原理 1.瓊脂糖凝膠電泳是最常用的鑑定dna的方法，基本原理與蛋白質電泳相似 簡便易行，只需少量dna 2.瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定於瓊脂...