一、實驗目的
1.學習並掌握用鹼裂解法提取質粒dna的方法；
2.學習並掌握了解質粒酶切鑑定的方法；
3.學習並掌握紫外吸收檢測dna濃度和純度的原理和方法；
4.學習並掌握pcr基因擴增的實驗原理和操作方法；
5.學習並掌握水平式瓊脂糖凝膠電泳的原理和使用方法。
二、實驗原理
1.pcr(多聚酶鏈式反應)
在dna聚合酶催化下，可以dna為模板，以特定引物為延伸起點，以dntp為原料，通過變性、退火、延伸等步驟， 在體外（緩衝液中）複製dna，使目的dna按2n方式呈指數形式擴增。
pcr一次迴圈的具體反應步驟為：
a.變性：加熱反應系統至95℃，使模板dna在高溫下完全變性，雙鏈解鏈 。
b.退火：逐漸降低溶液溫度，使合成引物在低溫（35－70℃,一般低於模板tm值的5℃左右），與模板dna互補退火形成部分雙鏈。
c.延伸：溶液反應溫度公升至中溫72℃，在 taq酶作用下，以dntp為原料，引物為複製起點，模板dna的一條單鏈在解鏈和退火之後延伸為一條雙鏈。
2.質粒dna的提取與製備
(1).鹼裂解法：
染色體dna與質粒dna的變性與復性存在差異：
a.高鹼性條件下，染色體dna和質粒dna均變性；
b.當以高鹽緩衝液調節其ph值至中性時，變性的質粒dna復性並儲存在溶液中，染色體dna不能復性而形成纏連的網狀結構，可通過離心形成沉沉澱去除。
(2).離心層析柱：
a.矽基質膜在高鹽、低ph值狀態下可選擇性地結合溶液中的質粒dna，而不吸附溶液中的蛋白質和多醣等物質；
b.通過去蛋白液和漂洗液將雜質和其它細菌成分去除；c.低鹽，高ph值的洗脫緩衝液將純淨質粒dna從矽基質膜上洗脫。
3.質粒dna的定量分析（紫外分光光度法）：
a.物質在光的照射下會產生對光的吸收效應，且其對光的吸收是具有選擇性；
b.各種不同的物質都具有其各自的吸收光譜:
dna分對波長260nm的紫外光有特異的吸收峰
蛋白質對波長280nm的紫外光有特異的吸收峰
碳水化合物對230nm的紫外光有特異的吸收峰
c.a260/a280及a260/a230的比值可以反應dna的純度；
a260/a280=1.8 dna純淨
a260/a280<1.8 表示樣品中含蛋白質（芳香族）或酚類物質
a260/a280>1.8 含rna雜質，用rna酶去除。
4.質粒dna的酶切鑑定：
限制性內切酶是dna重組操作過程中所使用的基本工具。限制性內切酶能特異性地與一段被稱為限制酶識別序列的特殊dna序列結合，或是與其附近的特異位點結合，並在結合位點切割雙鏈dna。
5.瓊脂糖凝膠電泳：
瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定於瓊脂糖的濃度。
dna分子在鹼性環境中帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。
dna分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應與分子篩效應：不同的dna，分子量大小及構型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區帶(遷移速度與分子量的對數值成反比關係).
三、材料與方法：
（一）實驗材料：
1.pcr
儀器：pcr儀、台式離心機、微量加樣槍、滅菌的薄壁離心管
材料：菌液【大腸桿菌dh5a菌株(pmd19-t質粒,含目的片段-綠色螢光蛋白gfp)】、無菌去離子水、2×premix taq、引物
2. 質粒dna的提取與製備
儀器：恆溫培養箱、台式離心機、離心層析柱、eppendorf管、微量加樣槍、離心管
材料：溶液 p1（s1）、溶液p2 (s2）、溶液p3（s3）、去蛋白液pe（w1）漂洗液wb（w2）、洗脫液eb（eluent)、含pmd19-t質粒的大腸桿菌dh5α
3. 質粒dna的定量（紫外分光光度法）
儀器：比色杯、紫外分光光度計、微量加樣槍
材料：蒸餾水、質粒ｄｎａ
4.質粒dna的酶切鑑定
儀器：1.5ml的ep管、微量加樣槍
材料：無菌水、10×m酶切緩衝液buf r、質粒dna、hind iii (15u/ul)、ecor i(12u/ul)
5.瓊脂糖凝膠電泳
儀器：凝膠電泳系統、凝膠成像系統
材料：電泳指示劑、gelview、tbe、瓊脂糖、dna marker 5000、電泳緩衝液
（二）實驗方法
1.pcr
2. 質粒dna的提取與製備
3. 質粒dna的定量（紫外分光光度法）
4.質粒dna的酶切鑑定
5.瓊脂糖凝膠電泳
四、結果與討論：
（一）實驗現象
1.加入溶液p1，出現懸浮現象；
2.加入溶液p2,溫和混勻，溶液會變得清亮；
3.加入溶液p3,有白色絮狀沉澱生成；
4.電泳時，可觀察到在電流作用下，點樣的溶液出現電泳現象，電泳速度不同。
在紫外檢測儀條件下，可以觀察到不同的物質出現不同的電泳帶。
（二）實驗結果
原始實驗資料
電泳後的**
a:pcr目的條帶
b:酶切片段
c:質粒dna
（四）實驗分析
1.由上資料可知，ratio=1.47
a260/a280<1.8 表明樣品中含有較多的蛋白質（芳香族）
2. 在**中，其他三類dna與maker相比較，可知質粒dna的分子大小在2500bp-3500bp，酶切反應的質粒dn**段分子大小在2800-3000bp和400-500左右，pcr的dna分子大小在400-500bp。基本符合預期。
（四）實驗討論
1.質粒dna中出現三條帶，分別對應超螺旋質粒dna、線性dna和開環狀質粒dna。這三種不同構型的分子有不同的遷移率，在一般情況下，遷移速度最快的為超螺旋型，其次為線性分子，最慢的為開環狀分子，所以條帶從上到下分別為：
超螺旋型dna、線性分子、開環狀分子。,
2.對於實驗結果中：a260/a280<1.8的可能原因為：
a.在質粒dna的提取實驗的「取上清液」步驟中吸入沉澱導致引入較多的蛋白雜質，進而導致後續實驗中因蛋白質量較多而難以去除。
b.可能為試劑汙染引起雜質蛋白的引入。
3.實驗中需注意的事項：
用微量加樣槍加試劑時，同種試劑可以不用換吸頭，每次換不同試劑時要記得換乙個新吸頭。
在pcr中，如果配好的反應液較多沾到管壁上，要將pcr反應管置台式離心機中瞬時離心，使反應液集中於管底，然後才將反應管放到基因擴增儀上。
在質粒dna提取的實驗中，加入溶液s2時，時間不能太久，動作要溫柔，輕輕顛倒幾次。
在電泳實驗中，點樣時槍頭下伸，點樣孔內不能有氣泡。
在電泳中，geldview有毒，切勿用手接觸。
思考題：
（1）鹼裂解法提取質粒時，溶液i、ii、iii的作用分別為？
答：溶液i：螯合金屬離子，抑制脫氧核酸酶對dna的降解作用；有利於溶酶體的作用。
溶液ii：細胞壁肽聚醣在鹼性下水解，核酸和蛋白質變性。
溶液iii：酸性條件下質粒dna復性，變性蛋白-sds+線性dna沉澱，na+可中和dna。
（2）結合實驗情況，如何提高限制性酶切的反應效率？
答：①盡量選擇粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。
②酶量的選擇任何時候2種酶的總量不能超過反應體系的1/10體積，而且最大反應體系最好不要小於20 ul，且酶切反應中甘油濃度應低於5%。
③底物dna的純度：主要汙染dna 的某些物質，如酚、氯仿、乙醇等均能抑制酶反應應盡量純化底物。
④反應系統：主要是反應緩衝液中的離子強度,如nacl和mg2+, 合適離子強度可以激發酶切反應。
質粒DNA的限制性內切酶酶切及其鑑定
2 酶反應終止液 10 兩種反應終止液可供選擇。0.1mol l edta na2，20 ficoll，適量橙g。0.25 溴酚藍，0.25 二甲苯青ff 或稱二甲苯藍 40 蔗糖水溶液 m v 或用30 蔗糖水溶液 實驗步驟 1，質粒dna的酶解 質粒dna酶解的反應成分及加樣量 2，瓊脂糖凝膠板...
2019質粒DNA的轉化和提取
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質粒DNA的提取及電泳檢測
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