普通生物學實驗報告
一、特異性目的片段dna的擴增
（一）實驗原理
聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,pcr）是體外酶促合成特異dn**段的一種方法，其基本原理為dna的半保留複製。pcr技術由①高溫變性模板 ；②引物與模板退火；③引物沿模板延伸這3步反應組成乙個迴圈，通過多次迴圈反應，目的dna得以迅速擴增。其主要步驟是：
將模板dna置於高溫下（通常為93℃-94℃），使其變性解成單鏈；人工合成的兩個寡核苷酸引物在其合適的復性溫度下分別與目的基因的兩條單鏈互補結合；熱穩定dna聚合酶（taq酶)在72℃將單核苷酸從引物的3』端開始摻入，以目的基因為模板按5』→ 3』的方向延伸，合成互補鏈。
本實驗採用物種特異性引物擴增的方法來鑑定3種不同物種**的肌肉。以不同物種**的動物dna為模板，用物種特異性的引物進行pcr擴增，只有在模板和引物的物種相對應的情況下才會有特異性條帶的出現。應用此方法，可以特異性地檢測樣品中痕量的特定dna成分。
（2）實驗步驟
1.不同反應體系的配製
按下錶將各成分分別加入一做好標記的無菌pcr管中，配製50μl的pcr反應體系，注意酶要最後加，加完後將pcr管放置在冰上。
2.將上述混合液稍加離心，約10s左右。取下後立即置於pcr儀中，蓋緊熱蓋，定好pcr儀的反應程式，執行擴增程式。
反應程式為：
預變性 94℃ 5min
變性 94℃ 5s
退火 50℃ 5s 迴圈30次
延伸 72℃ 20s
後延伸 72℃ 5min
3.反應結束後，終止程式，將pcr管取出，放置於4℃，待電泳檢測。
二、水平式瓊脂糖凝膠電泳法鑑定pcr產物
（一）實驗原理
核酸分子是兩性解離分子，在高於其等電點的電泳緩衝液（ph 8.0-8.3)中，其鹼基不解離，而磷酸集團全部解離，核酸分子因而帶負電荷，電泳時向正極遷移。
瓊脂糖主要是從海洋植物瓊脂中提取而來並經醣基化修飾，為一種聚合鏈線性分子。使用瓊脂糖凝膠作為電泳支援介質，發揮分子篩功能，使得大小和構象不同的核酸分子的遷移率出現較大差異，從而達到分離的目的。
（2）實驗步驟
1.制膠
稱取2.4g瓊脂糖，放入250ml的錐形瓶中，加入120ml1×tae緩衝液，微波爐高火加熱約40s直至沸騰，搖動，使瓊脂糖分散，在重複煮沸2次，直至溶液澄清透明。待瓊脂糖溫度降到60℃左右時，按1:
20000的濃度加入golden view,混勻後倒入已插上合適齒孔梳子的模具中，靜置，約30-45min後凝膠完全凝固。輕輕的垂直拔出梳子，將凝膠取出，放入電泳槽中，新增1×tae緩衝液至剛好沒過凝膠（有樣品孔的一端靠近負極）。
2.加樣
取15μlpcr產物與3μl的6×上樣緩衝液混勻，加入到凝膠樣品孔中。每加完乙個樣品應更換乙個吸頭。加樣前，要記下加樣的順序。
在每排樣品孔中留出乙個位置加入5μl的marker。
3.電泳
加樣後的凝膠板立即通電進行電泳，電壓100v，樣品由負極向正極移動。當溴酚藍移動到距離凝膠下緣約1/3時，停止電泳。
4.拍照
電泳完畢後，取出凝膠，採用凝膠成像系統拍照儲存。
3、實驗小結
（一）實驗結果
pcr 產物電泳結果
由上圖可以看出，樣品1和樣品6出現了目的條帶 （大小約200bp），所以dna模板1為豬肉dna，dna模板3為牛肉dna,dna模板2為兔肉dna。
（2）實驗討論
1.在加入taq酶時，應始終保持酶在冰浴中，不可握在手中。
2.每加完一次酶，都應更換吸頭。因為在加酶時，吸頭會插入液面以下，為防止汙染，應更換吸頭。
3.拔出梳子時，應兩端一起用力，垂直，緩慢地拔出，以免破壞膠孔。
4.將樣品與上樣緩衝液混合時，要反覆吸進，擠出溶液。為防止出現較多氣泡，在每次擠出溶液時，可在吸頭中殘留少量溶液。
5.在加樣時，吸頭要垂直於凝膠板且不要插入太深，以免破壞樣品孔。
6.我們組的電泳圖中，條帶不是很明顯，應該是加樣時樣品的量不夠充足，以後應注意。
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