此外，採用實時螢光定量pcr還能從方法學上有效的防止pcr實驗中交叉汙染的問題。因為螢光定量pcr中模板的擴增與檢測是同時進行的，當實驗完成後即可獲得定量結果，直接丟棄含有大量擴增產物的反應管，徹底避免了傳統方法中取出擴增產物進行電泳鑑定時擴增產物對實驗室造成二次汙染的可能性。
二． 螢光定量pcr的2類方法（按螢光產生的原理分類）
染料法（sybr green法）
染料法即利用sybr green分子產生的螢光訊號來進行樣品定量。該方法與常規的pcr類似，唯一的區別是在反應體系中加入了sybr green染料分子。該染料分子的激發波長為497nm，發射波長為520nm。
與eb的效能類似，sybr green也是一種扁平狀的分子，處於游離狀態時具有很低的螢光本底，當反應體系中存在dsdna時， sybr green能特異性的與之結合並在497nm激發下。
染料法的優點：1，無需設計、合成探針，實驗成本低；2，使用方便，與常規pcr的操作幾乎相同。
染料法的缺點：1，由於sybr green與dsdna的結合只具有結構特異性而不具有序列特異性，除了與特異性的靶序列擴增產物結合外，還能與在pcr擴增過程中形成的引物二聚體、非特異性擴增產物結合，從而造成擴增效率的降低、結果的不準確。因此採用該方法對於引物的設計及實驗條件的優化要求很高，確保反應過程中沒有非特異性產物的擴增；2，由於sybr green的上述特點，該方法不能應用於multiplex qpcr技術。
（在乙個反應管中同時檢測多個目的基因的表達情況）
探針法（以taqman探針為例）
探針法螢光定量pcr與常規pcr的不同之處在於：在上、下游引物外還加入了具有序列特異性的探針（探針本身具有螢光標記），該探針根據需要擴增的靶序列設計因此只能與待檢測序列結合，與染料法相比提高了實驗的特異性。目前市場上的探針主要種類有：
taqman、molecular beacon、scorpions、hybirdization等，其中以taqman探針應用最廣泛。
taqman探針的結構：長度與普通pcr引物類似，大約20bp左右。在5』與3』端各標記有乙個螢光基團，5』的螢光基團稱為報告基團（report），3』的螢光基團稱為淬滅基團（quencher）。
taqman探針的效能：在探針結構完整的情況下用特定的波長激發報告基團，由於報告基團與淬滅基團的空間位置很近，因此報告基團能夠通過fret（fluorescence resonance energy transfer）將接受的能量轉移到淬滅基團，使後者以發射螢光或熱量的方式釋放能量，而報告基團並不發射特定波長的螢光訊號。
taqman探針法工作原理：
變性（95°c）：模板dsdna充分解鏈；
復性、延伸、酶切降解（60°c）：1，探針與靶序列結合；上、下游引物與靶序列結合；3，上、下游引物在taq酶的作用下合成互補鏈（5』→3』聚合功能）；4，當上游引物延伸到taqman探針的5』端時，延伸不能繼續，此時taq酶發揮5』→3』外切功能將探針逐一水解並繼續向前延伸直至完成互補鏈的合成；
螢光訊號的檢測：由於taqman探針被水解，報告基團在受到激發後不能再通過fret作用將接受的能量轉移給淬滅基團，因此可以檢測到報告基團特定波長的螢光訊號，起始模板濃度越高螢光訊號越強。
與染料法相比taqman探針法的優點：1，實驗的特異性得到了提高；2，對探針的5』端採用不同的螢光標記就可以進行multiplex qpcr。
與染料法相比taqman探針法的缺點：1，探針的使用提高了實驗成本；2，探針的使用需要設計及優化。
三． 確定樣品起始模板拷貝數的2類方法
絕對定量
採用絕對定量的方法需要使用標準品（已知起始拷貝數的樣品）建立標準曲線，建立ct值與樣品起始模板拷貝數的對數之間的線性關係，從而通過實驗後樣品的ct值得出起始模板量。
標準品的種類：含目的基因的質粒（經酶切線性化處理，其中的插入片段必須採用與qpcr實驗中相同的引物擴增得到）、pcr擴增產物（經純化，必須採用與qpcr實驗中相同的引物擴增得到）、化學合成的寡聚核苷酸、cdna、gdna等，前2種標準品使用較為廣泛。
標準品的定量：uv a260、螢光分光光度檢測等。
為了使實驗最終得到的ct值之間具有可比性，必須進行歸一化的處理：1，對各樣品進行細胞計數，使各樣品的起始細胞數一致（可操作性不強，尤其是針對組織、腫瘤等樣品）；2，對純化後得到的總rna進行定量，使各樣品進行rt-pcr時加入的rna用量一致。
相對定量
與絕對定量不同，相對定量不關心每個樣品中目的基因表達產物（mrna）的具體拷貝數，而關注目的基因在不同的細胞型別、不同的發育週期等條件下不同的轉錄效率，即基因的差異化表達。就研究目的而論，該方法比絕對定量的應用範圍更廣泛、更符合研究的目的。某目的基因在樣品與對照品間表達差異倍數的計算公式如下：
公式說明：
rel.quantity：目的基因在樣品與對照品間表達差異的倍數；
goi：目的基因（gene of interest）；
norm：內參基因（reference gene，normalizer，house keeping gene）
eff：pcr擴增效率，分子部分為目的基因擴增效率，分母部分為內參基因的擴增效率；
使用該公式時，需要通過實驗分別確定目的基因與內參基因的擴增效率然後代入公式進行計算；如果目的基因與內參基因的擴增效率都接近於100%且相差小於5%，也可將pcr擴增效率預設為100%，這樣公式就簡化為2-δδct 。
為什麼需要設立內參基因？
如果僅僅比較目的基因的δct是不能準確反映樣品間目的基因的表達差異的，最主要是受到3個變數的影響：1，樣品處理時不同的純化得率；2，rt-pcr過程中不同的逆轉錄效率；3，qpcr反應體系中不同的cdna加入量。由於上述3個變數在樣品間都很難控制在相同的水平上，因此需要引入內參基因來矯正上述變數進行歸一化處理，使得所有樣品目的基因表達水平的比較是在相同的水平上進行的，這樣得出的結果才具有可信性與良好的重複性。
（注意：內參基因的（1+effδct）位於分母的位置，進行除法的運算。）
如何選擇內參基因？符合什麼標準的基因可以作為內參基因？
由於上述內參基因的用途，因此內參基因的選擇必須滿足以下3個條件：1，在不同的細胞、組織中具有恆定的表達；2，在不同的細胞週期、發育週期中具有恆定的表達；3，在不同的實驗狀態下具有恆定的表達。內參基因的δct一般小於2（即小於1倍的表達差異），一般採用的內參基因都是一些管家基因，使用最多的為：
-actin、gapdh、18srna等。
需要注意的是：並非傳統意義上的管家基因都能作為內參基因，還是需要與具體的實驗結合起來綜合考慮。例如gapdh在ii型糖尿病病人中就明顯的高表達，不能作為內參基因。
因此在選擇內參基因時建議：1，查閱相關文獻；2，設立多個內參基因；3，採用表達譜的方法確定理想的內參基因。
採用singleplex還是multiplex？
可以採用singleplex的方法在不同的反應管內得到同一樣品目的基因與內參基因的ct值，再利用上述公式進行計算。在這種情況下可以使用sybr green法進行實驗。
也可採用multiplex的方法在乙個反應管內得到同一樣品目的基因與內參基因的ct值，再利用上述公式進行計算。採用taqman探針法（目的基因與內參基因的探針進行不同的螢光標記）可以採用multiplex的方法。
multiplex對於singleplex的優點：1，節約了樣品的使用量，尤其是針對樣品比較珍貴的情況；2，可以加快實驗的速度，節約實驗成本；3，避免了singleplex的誤差，因為目的基因與內參基因是在不同的反應管內得到的。
四． 引物與探針的設計
qpcr引物設計與常規pcr引物設計的原則基本相同，需特別注意的就是為了盡可能使pcr擴增的效率達到100%，因此qpcr擴增產物的片段長度一般小於400bp，在設計引物的時候盡可能將產物長度控制的短些。
引物與探針設計的要求：1，高pcr擴增效率，接近100%；2，高特異性，擴增過程中沒有非特異性產物；3，實驗的重複性，相關係數接近1。
sybr green法（引物設計基本原則）
pcr擴增產物長度範圍100~400bp，擴增片段中避免出現強烈的二級結構；
引物的gc含量為30~80%，最佳範圍50~60%；
引物的tm值範圍為62~67°c，上、下游引物的δtm小於2°c；
引物序列中避免出現連續4個相同的鹼基；
避免引物本身或引物間形成二級結構，在引物3』端最後5個鹼基中避免出現2個以上的g或c；
引物最好設計在不同exon的區域，其間含有一些比較大的intron；
利用blast或其他引物設計軟體（如beacon designer）
對引物的特異性進行檢查。
taqman探針法（引物設計基本原則）
pcr擴增產物長度範圍70~150bp，擴增片段中避免出現強烈的二級結構；
先確定探針的位置與序列再設計相對應的引物；
引物的gc含量為30~80%，最佳範圍50~60%；
引物的tm值範圍為58~60°c，上、下游引物的δtm小於2°c；
引物序列中避免出現連續4個相同的鹼基；
避免引物本身或引物間形成二級結構，在引物3』端最後5個鹼基中避免出現2個以上的g或c；
引物最好設計在不同exon的區域，其間含有一些比較大的intron；
利用blast或其他引物設計軟體（如beacon designer）
對引物的特異性進行檢查。
taqman探針法（探針設計基本原則）
先確定探針的位置與序列再設計相對應的引物；
探針的gc含量為30~80%，最佳範圍40~60%；
探針的tm值比上、下游引物的tm值高10°c；
探針5』端的第乙個鹼基不能是g；
探針5』端第乙個鹼基與上游引物3』端最後乙個鹼基的距離控制在1~10bp範圍內；
探針序列中避免出現連續3個以上相同的鹼基，尤其是g；
採用分析軟體（如beacon designer）分析，避免探針本身或探針與引物間形成強烈的二級結構。
五． qpcr實驗優化的3大指標
與引物、探針設計的要求相同，qpcr實驗優化的目的就是獲得：1，高pcr擴增效率；2，高特異性；3，良好實驗的重複性；4盡可能廣的檢測動力學範圍。一般在採用設計好的引物與探針進行大規模樣品實驗前，需要通過預實驗確認pcr擴增效率、特異性、重複性並進行優化。
實時螢光定量PCR技術
一 實驗目的 1 了解pcr 的原理並熟悉其操作的方式。2 學會使用pcr儀進行定量或定性的分析。二 實驗原理 常規pcr中，在擴增反應結束之後，我們一般通過凝膠電泳的方法對擴增產物進行定性的分析，無法對pcr擴增反應進行實時檢測，也無法對起始模板準確定量，而很多情況下，我們所感興趣的是起始模板量，...
螢光定量PCR從標準曲線的製作到基因表達分析
定量pcr定量的基本原理就是用已知拷貝數梯度稀釋的樣品作出標準曲線，未知樣品和標準曲線相比較從而得到未知樣品的量。無論是在基因表達分析實驗還是在病原微生物檢測應用中都有可能要做標準曲線，分別用於絕對定量和相對定量。標準樣品的準備 1 絕對定量。絕對定量就是要確定未知樣品的拷貝數。對於這類實驗標準品是...
定量研究方
定量研究方法 推斷統計 中山大學梁巨集 內容提要 抽樣的意義是什麼？為什麼隨機樣本可以代表總體？隨機樣本和總體是通過什麼聯絡起來？什麼是抽樣分布？了解不同統計量及樣本量對應的抽樣分布樣本統計量推斷總體特徵 引數估計樣本統計量檢驗總體引數 假設檢驗了解不同情況下的總體檢驗 抽樣的意義 抽樣的意義 社會...