microRNA實時定量莖環RT PCR的技術

2023-02-15 03:57:05 字數 4683 閱讀 2079

摘要: 已開發出一種新型的microrna(mirna)的定量方法,即利用莖環反轉錄,taqman pcr分析。莖環rt引物在rt 效率和特異性方面比傳統的更好。

taqman mirna的檢測是很具體的,可以檢測成熟mirna和區分相關的甚至低至乙個核苷酸的mirnas。此外,他們不會受到基因組dna汙染的影響。精確量化可以從低至25皮克的總rna中提取大多數mirna。

事實上,這種方法靈敏度高,特異性強和精密度高,允許無需核酸純化,直接分析單個細胞。如標準taqman基因表達分析,taqman mirna的檢測顯示出了7個數量級的動態範圍。七個小鼠組織中五個mirna定量顯示,在每個細胞中,有低至10到超過30000個拷貝數。

這種方法可以確保快速,準確,靈敏mirna表達譜,並能識別和監控特定組織或疾病的潛在生物標誌物。莖環rt-pcr可用於其他小rna分子,如短干擾rna(sirnas)的量化。此外,為更好的特異性和效率,莖環rt引物設計的概念可以應用在小分子rna轉殖和多重檢測。

引言: mirna是自然發生的,高度保守的轉錄家庭,**於較大的髮夾前體。mirna是在動物和植物的基因組上發現的。

到目前為止,有1000個獨特的轉錄產物,其中,在桑格中心mirna的登錄檔中包括326人類mirna。

mirna是通過催化mrna的**或抑制mrna的翻譯來調節基因表達。他們被認為在細胞發育,分化和傳導中發揮著重要作用。具體職責包括調節細胞增殖和新陳代謝,發育時間,細胞死亡,造血,神經發育,人類腫瘤形成與dna甲基化和染色質修飾。

雖然mirna的相對豐富的轉錄產物類別,其表達水平在物種和組織之間相差很大。低豐度的mirna經常逃避檢測技術,如轉殖,northern雜交和基因晶元分析。這裡,我們提出一種新型實時定量方法,能夠準確靈敏地檢測mirna與其他小分子rna。

這種方法擴充套件了實時pcr技術,從大分子的基因表達到微分子的變化檢測。

材料和方法

從桑格中心的mirna註冊** ***m/mirna/中篩選目標,引物和探針。所有taqman mirna檢測,可通過應用生物系統公司(p / n4365409)得到。mirna標準taqman分析,採用primerexpress軟體設計pri-let-7a-3和pri-mir-26b和mirna前體mir-30a。

所有序列在補充資料部分可用。合成mirna的寡核苷酸從integrated dna technolo-gies (idt, coralville, ia)購買。

rna樣本組織,細胞,細胞裂解物和總rna製備

從ambion公司(p / n7810,7812,7814,7816,7818,7824,7826和7968)購買10-12天老鼠的腦,心,肝,肺,胸腺,卵巢和胚胎的總rna樣品。 ambion公司鼠的總rna來自瑞士韋伯斯特小鼠。基於taqman基因表達分析人類或小鼠的3 - 磷酸甘油醛脫氫酶(gapdh)內對照(p / n4310884e4352339e,應用生物系統公司)所有的rna樣品進行標準化。

兩個細胞株hepg2和op9,培養,使用gibco公司mem(p / n 12492-021,invitrogen,carlsbad, ca)補充10%胎牛血清(fbs)(p/n: sh30070.01, hyclone, logan, ut)培養。

用血球計對胰酶消化細胞計數。約2.8×106個懸浮細胞通過離心沉澱,離心5分鐘,用1毫公升不新增 mgcl2 and cacl2的杜爾貝科的磷酸鹽緩衝液(pbs)洗滌。

細胞再懸浮於140毫公升pbs,並用三種不同的樣品製備方法處理。第一種方法,乙個50毫公升的樣本(106個細胞)等量的核酸純化裂解液混合,用吸管反覆吹打十次,然後旋轉。在新增到rt反應體系前,將裂解液用1 u / ml的rnase抑制劑溶液稀釋1/10。

在第二種方法中,用mirvana_mirna提取試劑盒提取50毫公升的樣本(106個細胞)。純化的總rna在100毫公升洗脫緩衝液中洗脫。第三種方法用1×pbs稀釋1/2,95℃加熱5分鐘,在加入rt反應體系前立即在冰上儲存。

用mirvana_ mirna檢測試劑盒檢測mirna

根據製造商的協議,使用mirvana-mirna的檢測試劑盒對mirna雜交分析。由idt合成rna探針。放射性同位素標記的rn**段用氣旋儲存螢光粉系統進行檢測和定量。

反轉錄酶反應

逆轉錄反應中包含的rna樣品,包括純化總rna,細胞裂解物,和熱處理細胞,50奈米的莖環rt引物,1×rt緩衝液,每dntps濃度0.25公釐,3.33 u / l 的逆轉錄酶和0.

25 u / l的rnase抑制劑。7.5微公升反應體系在9700溫度迴圈器96- 或 384-平板上16℃培養30分鐘,42℃30分鐘,85℃5分鐘,然後保持4℃。

所有逆轉錄反應,包括無模板對照和rt負對照,都進行一次重複。

pcr 採用標準的taqmanpcr試劑盒進行實時pcr。 10μlpcr反應體系包括0.67μlrt產物,1×taqman mix ,0.

2μm的taqman探針,1.5m m正向引物和0.7m反向引物。

反應在 384-平台上95℃培養10分鐘,95℃15秒60℃1分鐘40個迴圈。所有的反應一式三份。 c t為在螢光通過固定閾值的迴圈數。

螢光定量ct值轉換成絕對數量的拷貝數,使用合成林-4 mirna的標準曲線。

結果 我們提出了乙個新的mirna的定量的實時rt-pcr技術方案。它包括兩個步驟:rt和實時pcr。

首先,莖環rt引物是與mirna分子雜交,然後用multi-scribe反轉錄。接下來,用傳統的taqman pcr,對rt產品進行定量。

圖1。上圖描述的是taqman mirna的檢測原理,基於taqman實時定量mirna的包括兩個步驟,莖環rt和實時pcr。莖環rt引物結合在mirna分子的3'端和用反轉錄酶逆轉錄。

然後,rt產品使用傳統的taqman pcr定量,其中包括特定mirna的正向引物,反向引物和染料標記的taqman探針。尾正向引物5'的作用是根據mirna分子的序列組成增加其熔融溫度(tm)。

圖2。taqman-4 mirna的檢測的動態範圍和靈敏度。 (a)4超過7個數量級的 lin-4 mirna擴增曲線。

合成的rna輸入範圍從1.3×10-3 fm(相當於每次反應7個拷貝數) 1.3×104 fm(相當於每次反應7×107拷貝數);(b)lin-4 mirna的標準曲線。

mirna定量的動態範圍和靈敏度的計畫使用一種人工合成的cel-lin-4靶進行首次評估。合成的rna在 a26值的基礎上量化,稀釋超過7個數量級。 cel-lin-4 taqman mirna的檢測結果顯示在目標輸入和ct值之間有極好的線性關係,表明,該檢測有至少7個動態範圍,並能夠檢測pcr反應中少於7個的拷貝數(圖2)。

採用小鼠肺總rna的八個額外mirna的檢測也被證實。rna的輸入範圍從0.025到250納克(圖3)。

相關的rna輸入的thect 值超過4個數量級(r2>0.994)。陰性對照檢測中,即使在250納克總rna滑鼠的反應中,cel-mir-2沒有給出乙個檢測訊號。

根據七個不同的鼠組織中五個mirna的表達譜測定,建立乙個mirna的表達圖譜。每個細胞中的拷貝數根據輸入的總rna(假設15皮克/細胞)和合成lin-4目標的標準曲線計算。從這個表達圖譜上作了一些有趣的觀察。

首先,mirna非常豐富,組織中每個細胞平均有2390個拷貝數。每個細胞表達的拷貝數在10-32090之間變化。在所有組織中,12個mirna裡,mir-16和mir-323是最豐富和最低量表達的mirna。

此外,每個組織都有獨特的mirna的表達水平。mirna表達的整體水平在小鼠肺中最高和胚胎中最低。最後,在7個組織中,mirna表達的動態範圍變化很大,從不到5倍(let-7a)到超過2000倍(mir-323) (表1)。

評估rna分離的需要,我們直接在mirna的檢測中增加了細胞裂解物。相當於直接在7.5毫公升逆轉錄反應中新增2.

5-2500細胞。當檢測到,在一些細胞中ct值相關r2>0.998)的rt反應至少有三個數量級(圖4)。

圖3。總rna輸入的閾值迴圈(ct)值檢測8個mirna的相關性。每rt反應中,小鼠肺總rna輸入範圍從0.

025到250納克。將新桿狀線蟲的mirna(mir-2)列入作為陰性對照。

鼠或人的腦,心,肝,肺,胸腺,卵巢和胚胎(10-12天)的總rna樣品均購自ambion公司。根據標準曲線lin-4合成的mirna對每個細胞拷貝數進行估計。每個rt反應中新增150ng的rna(或相當於約10 000個細胞,假設每個細胞中有15pg總rna)。

依據taqman磷酸甘油醛脫氫酶的內對照(p / n4352339e)將rna規範化輸入。

檢測了12組非特定的基因組dna對taqman mirna的影響。結果表明,rt反應中是否新增5納克人類基因組dna對ct值沒有影響,表明rna的目標(資料未顯示)檢測是非常特異的。基於這一觀察,我們直接mirna定量檢測中增加了熱處理細胞。

圖5顯示了使用純化總rna,細胞裂解物,從同樣數目的hepg2細胞得到的熱處理細胞的mirna進行定量比較。直接新增熱處理細胞的mirna的檢測ct值最低,和其他三種不同的樣品製備方法相似。

圖4。使用op9細胞裂解物檢測taqman mirna的動態範圍。 每個rt體系中輸入細胞數範圍為3至2500個細胞。

採用新桿狀線蟲elegans mirna(mir-2)作為陰性對照。

圖5。對熱處理細胞,細胞裂解液和10 mirna實時定量總rna進行比較。用閾值迴圈(ct)來衡量mirna的表達水平。每pcr擴增約400 hepg2細胞進行了分析。

圖6。的taqman mirnamir-16的分析比較來解決以印跡雜交為基礎的分析。總rna來自小鼠腎,肝,肺,脾和**組織。

由兩個獨立執行系統(資料未顯示)對12 mirna16重複檢測taqman mirna的可再現性。ct的標準偏差平均為0.1,顯示檢測的高精度。

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