定量pcr定量的基本原理就是用已知拷貝數梯度稀釋的樣品作出標準曲線，未知樣品和標準曲線相比較從而得到未知樣品的量。無論是在基因表達分析實驗還是在病原微生物檢測應用中都有可能要做標準曲線，分別用於絕對定量和相對定量。
標準樣品的準備
1、絕對定量。絕對定量就是要確定未知樣品的拷貝數。對於這類實驗標準品是通過某種方法製備得到的已知拷貝數的含有目標片段的核苷酸序列。
最常見的是插入有目標序列的質粒，因為質粒是環狀dna有較強的穩定性，而且分子量比較大定量的時候比較準確。也有用線狀的pcr產物作為標準品的，通常要比擴增的目標片段要大一些，這也是為了獲得分子量比較大的片段，提高拷貝數的準確性。標準品的拷貝數是通過紫外定量的方法來確定，先得到標準品的濃度c(ng/ul)，因為無論是質粒還是pcr產物它們的序列都是已知的，這樣通過通過核苷酸的相對分子量和標準品序列資訊估算出標準品的分子量b，這樣標準品的拷貝數a(copy/ul) 為：
a=c/b×6.02e+14
2、相對定量。主要是針對基因表達分析實驗而來的，因為要知道都是相對的數值（對照樣品和實驗樣品中基因表達的比值），這樣就不需要知道精確的拷貝數，所以標準品也就無須知道精確的拷貝數，只需知道稀釋的倍數就可以了。
實驗中的標準品可以是**比較豐富的細胞或組織的rna轉錄得到的cdna。將這種cdna進行梯度的稀釋，可以是稀釋10倍，100，1000，10000等倍（具體實驗要根據具體的情況來調整稀釋倍數。最好能作乙個預實驗來看看什麼樣的稀釋倍數比較適合這種基因的擴增）。
而對於各個稀釋倍數要對它的拷貝數進行賦值，這個值當然不是標準品中真實含有的基因數量，當然在基因表達分析中也不需要，而是要求根據稀釋倍數給每乙個稀釋度人為賦予的拷貝數，這只是為了方便實驗最終結果的計算而已。比如可以把前面稀釋十倍的樣品賦值為10000個拷貝，100倍的賦值為1000個拷貝依次類推把10000倍的賦為10等。要注意，賦值的數目的倍數差異和稀釋的倍數應該是一樣的，比如前面是10稀釋，後面賦值也是10倍變化。
如何做標準曲線
在定量實驗中標準品是要和未知樣品一起進行定量實驗的，這樣在實驗結束，無論是標準品還是未知樣品都將跑出曲線，獲得了ct值。那麼先可以把未知樣品放到一邊，對於標準品來說，既獲得了ct值，還知道他們的拷貝數（雖然對於相對定量來說這個拷貝數是我們自己賦予的）。這樣可以通過標準品的ct值和拷貝數做一條標準曲線（以拷貝數為橫座標，而ct值為縱座標）。
一旦作出了標準曲線，而未知樣品的ct值知道（通過實驗求得的），這時候就在標準曲線上進行定位，就可以得到未知樣品的拷貝數了。
事實上，操作起來沒有那麼複雜，只需要告訴軟體哪個孔是標準品，哪個是未知樣品，以及標準品的拷貝數等必要資訊，軟體會自動幫把標準曲線和未知樣品的拷貝數計算出來了。
舉例來說如何進行設定
1、先進入軟體，在板設定中選擇所放樣品的位置，並標上unknow或standard等資訊。
2、選擇要使用的螢光染料。
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