一、實驗目的：
1、了解pcr 的原理並熟悉其操作的方式。
2、學會使用pcr儀進行定量或定性的分析。
二、實驗原理：
常規pcr中，在擴增反應結束之後，我們一般通過凝膠電泳的方法對擴增產物進行定性的分析，無法對pcr擴增反應進行實時檢測，也無法對起始模板準確定量，而很多情況下，我們所感興趣的是起始模板量，如轉基因動植物中插入某種外源基因的拷貝數或者病人中某種病毒dna/rna的精確copy數等，如此，螢光定量pcr技術便應運而生。
2.1、螢光定量pcr概念
所謂定量pcr技術（real-timepcr），是指在pcr反應體系中加入螢光基團，利用螢光訊號累積實時監測整個pcr程序，最後通過特定數學原理對未知模板進行定量分析的方法。
2.2、螢光定量pcr與普通pcr的主要區別
理論上pcr是乙個指數增長的過程，但是實際的pcr擴增曲線並不是標準的指數曲線，而是s形曲線。
這是因為隨著pcr迴圈的增多，擴增規模迅速增大，taq酶、dntp、引物，甚至dna模板等各種pcr要素逐漸不敷需求，pcr的效率越來越低，產物增長的速度就逐漸減緩。當所有的taq酶都被飽和以後，pcr就進入了平台期。由於各種環境因素的複雜相互作用，不同的pcr反應體系進入平台期的時機和平台期的高低都有很大變化，難以精確控制。
所以，即使是96次pcr重複實驗，各種條件基本一致，所得結果有很大差異，所以在實驗過程中我們不能根據最終pcr產物的量直接計算出起始dna拷貝數。
2.3、螢光定量pcr中的概念
2.3.1擴增曲線
螢光定量pcr擴增曲線可以分成三個階段：螢光背景訊號階段（基線期），螢光訊號指數擴增階段（對數期）和平台期。在基線期，擴增的螢光訊號被螢光背景訊號所掩蓋，我們無法判斷產物量的變化。
而在平台期，擴增產物已不再呈指數級的增加。由於pcr的終產物量與起始模板量之間沒有線性關係，所以根據最終的pcr產物量不能計算出起始dna拷貝數。只有在螢光訊號指數擴增階段，pcr產物量的對數值與起始模板量之間存**性關係，我們可以選擇在這個階段進行定量分析。
2.3.2螢光閾值
我們一般把螢光pcr的前15個迴圈訊號作為螢光本底訊號（baseline，基線期），即樣本的螢光背景值和陰性對照的螢光值，擴增的螢光訊號被螢光背景訊號所掩蓋。螢光閾值是在螢光擴增曲線上人為設定的乙個值，它可以設定在螢光訊號指數擴增階段任意位置上，螢光域值的預設設定是3～15個迴圈的螢光訊號的標準偏差的10倍（機器自動設定）。
2.3.3 ct值
ct值就是在螢光pcr擴增過程中，當擴增產物的螢光訊號達到設定的閾值時所經過的擴增迴圈次數。
因為ct值即達到螢光閾值所經過的迴圈數，所以它就與模版的拷貝數存在著線性關係，起始拷貝數越多，經過的迴圈數就越少，ct值也就越小，反之亦然。正常的ct值範圍在18-30之間，過大和過小都將影響實驗資料的精度。
前面也提到過，同一模板經過96次pcr擴增，擴增產物雖然不恆定，但ct值極具重現性。根據這個特點，我們可以利用已知起始拷貝數的標準樣品的ct值做出標準曲線，只要在同一次pcr實驗中得到未知樣品的ct值，就可以根據曲線算出該未知樣品的起始拷貝數。
2.3.4標準曲線
在絕對定量實驗過程中，我們可以將已知濃度的標準品進行梯度稀釋，將未知樣品和梯度稀釋的標準品在同一螢光pcr實驗中進行反應，將稀釋標準品得到的ct值構建標準曲線，通過標準曲線可以推算出未知樣品的量。
2.3.5擴增效率
擴增效率與標準曲線的斜率相關，計算方程為：擴增效率（e）＝10-1/斜率。理論上，在每個指數擴增迴圈中，pcr產物的量加倍，即pcr產物2倍增加，反應效率為2，擴增效率就為2，就可得2＝10-1/斜率，標準曲線得斜率就為-3.
32，斜率得絕對值與螢光曲線間距相同。
2.4、螢光定量pcr的方法
螢光定量pcr所使用的螢光化學可分為兩種：螢光探針和螢光染料。而螢光定量pcr的方法相應的可分為特異類和非特異類兩類，特異性檢測方法是在pcr反應中利用標記螢光染料的基因特異寡核苷酸探針來檢測產物；而非特異性檢測方法是在在pcr反應體系中，加入過量螢光染料，螢光染料特異性地摻入dna雙鏈後，發射出螢光訊號。
前者由於增加了探針的識別步驟，特異性更高，但後者則簡便易行。
螢光定量pcr最常用的方法是dna結合染料sybrgreenⅰ的非特異性方法和taqman水解探針的特異性方法，在這裡主要介紹這2種方法，其它方法請參考其它螢光定量pcr資料。
2.4.1非特異性sybrgreeni染料法
sybrgreeni是一種結合於所有dsdna雙螺旋小溝區域的具有綠色激發波長的染料，在游離狀態下，sybrgreeni發出微弱的螢光，但一旦與雙鏈dna結合後，螢光大大增強。因此，sybrgreeni的螢光訊號強度與雙鏈dna的數量相關，可以根據螢光訊號檢測出pcr體系存在的雙鏈dna數量。sybrgreeni的優點：
實驗設計簡單，僅需要設計上下游一對引物，不需要設計探針，無需設計多個探針即可快速檢驗多個基因，通用性好；成本低；能夠通過溶解曲線分析檢驗擴增產物的特異性。因而在低通量實驗和單重實驗時一般優先考慮使用sybrgreeni染料法。
sybrgreeni的缺點：由於sybrgreeni與所有的雙鏈dna相結合，因此由引物二聚體、單鏈二級結構以及錯誤的擴增產物引起的假陽性會影響定量的精確性，sybrgreeni方法對pcr擴增特異性要求較高。實驗過程中通過溶解曲線來分析產物的均一性有助於分析由sybrgreeni得到定量結果。
另外，因為sybrgreeni不能區分不同擴增子發出的螢光而導致它不能用於多重反應。
溶解曲線分析
溶解曲線分析可以用來確定不同的反應產物，包括非特異性產物。擴增反應完成後，通過逐漸增加溫度同時監測每一步的螢光訊號來產生溶解曲線，隨著反應中雙鏈dna變性，螢光染料又回覆到游離狀態導致螢光訊號降低，用螢光訊號改變的負的一次導數與溫度作圖，在擴增產物的溶解溫度上有一特徵峰（tm，dna雙鏈解鏈50％的溫度），用這個特徵峰就可以將特異產物與其它產物如引物二聚體區分開，因為它們在不同的溫度溶解。
2.4.2特異性taqman水解探針法
taqman螢光定量技術是以taqman螢光探針為基礎，taqman螢光探針為一寡核苷酸，兩端分別標記乙個螢光發射基團和乙個螢光淬滅基團。探針完整時，發射基團發射的螢光訊號被淬滅基團吸收。pcr擴增時，taq酶的5』－3』外切酶活性將探針酶切降解，使螢光發射基團和螢光淬滅基團分離，從而螢光監測系統可接收到螢光訊號，即每擴增一條dna鏈，就有乙個螢光分子形成，實現了螢光訊號的累積與pcr產物形成完全同步。
常用的螢光基團是fam，tet，vic，hex。
由於taqman探針法中，除引物外，還使用了一條特異的探針，因此此方法可以特異的檢測目標序列，防止非特異產物的干擾影響定量的準確性，同時它也可以用於多重反應，但探針設計成本較高，有時探針設計困難。
2.5、螢光定量分析方法
2.5.1絕對定量演算法
絕對定量分析用於確定未知樣本中某個核酸序列的絕對量值，即通常所說的拷貝數。
絕對定量的標準樣品：已知拷貝數的質粒dna，做系列稀釋。
2.5.2相對定量演算法- - δδct
δδct法是一種非常普遍的技術，它比較了包括對照樣品(如未處理或野生型樣本)和內參基因(如看家基因表達)在內的實驗樣本的結果。採用該方法，可根據檢測樣本和對照樣本中的內參基因(正常)基因的ct調整同樣兩個樣本中的目的基因(goi)的ct。其得出的δδct值可用於測定表達的倍數差異，倍數差異 = 2 -δδct。
△△ c t= （ ct未知樣品目的基因 －ct未知樣品內參基因）－（ct基準樣品目的基因 －ct基準內參基因)
本實驗以處理和未處理的肝癌細胞做材料，用sybr green螢光化學法，**雙標準曲線相對定量分析的試驗操作方法以及基因的表達差異。
三、實驗方案與流程：
3.1 rna 的提取
1、向每107個細胞中加入0.5-1 ml的rnaiso plus。
2、用移液槍反覆吹吸直至裂解液中無明顯沉澱。
3、室溫靜置5分鐘。
4、12000g 4℃離心5分鐘。
5、小心吸取上清液，移入新的離心管中（切勿吸取沉澱）。
6、向勻漿裂解液中加入氯仿（rnaiso plus的1/5體積量），蓋緊離心管蓋，用手劇烈**15s(氯仿沸點低、易揮發，**時應小心離心管蓋突然彈開)，待溶液充分乳化（無分相現象）後，在室溫靜置5分鐘。
7、12000g 4℃離心15分鐘。
8、從離心機中小心取出離心管，此時勻漿液分為三層，即：無色的上清液、中間的白色蛋白層及帶有顏色的下層有機相。吸取上清液轉移至另一新的離心管中（切忌吸出白色中間層）。
9、向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻後，在15-30℃下靜置10分鐘。
10、12000g 4℃離心10分鐘。一般在離心後，試管底部會出現沉澱。
11、小心棄去上清，緩慢地沿離心管壁加入75﹪的乙醇1 ml（切勿觸及沉澱），輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，12000g 4℃離心5分鐘後小心棄去乙醇（為了更好地控制rna中的鹽離子含量，應盡量除淨乙醇）。
12、室溫乾燥沉澱2-5分鐘（不可以離心或加熱乾燥，否則rna將會很難溶解），加入適量的rnase-free水溶液沉澱，必要時可用移液槍輕輕吹打沉澱，待rna沉澱完全溶解後與-80℃儲存。
3.2 rna 含量的測定
根據***x 測定出rna的含量，計算出100ng所需的rna的體積，然後按下述操作加入各種物質，使其體積達到25ul。
待測樣品基因的pcr
pcr的程式設定：
pattern 1: 反轉錄反應
hold
42℃ 5min
95℃ 10 sec
pattern 2: pcr 反應
cycle : 40
95℃ 10 sec
60℃ 30 sec
pattern 3: dissociation
四、實驗裝置與材料：
主要裝置：pcr儀、離心機、振盪器。
主要材料：肝癌細胞（處理過的和未處理過的），1ml、100ul的移液槍，槍頭，染料（sybr green1），2種引物等。
實時螢光定量PCR方法簡介
此外，採用實時螢光定量pcr還能從方法學上有效的防止pcr實驗中交叉汙染的問題。因為螢光定量pcr中模板的擴增與檢測是同時進行的，當實驗完成後即可獲得定量結果，直接丟棄含有大量擴增產物的反應管，徹底避免了傳統方法中取出擴增產物進行電泳鑑定時擴增產物對實驗室造成二次汙染的可能性。二 螢光定量pcr的2...
螢光定量PCR從標準曲線的製作到基因表達分析
定量pcr定量的基本原理就是用已知拷貝數梯度稀釋的樣品作出標準曲線，未知樣品和標準曲線相比較從而得到未知樣品的量。無論是在基因表達分析實驗還是在病原微生物檢測應用中都有可能要做標準曲線，分別用於絕對定量和相對定量。標準樣品的準備 1 絕對定量。絕對定量就是要確定未知樣品的拷貝數。對於這類實驗標準品是...
microRNA實時定量莖環RT PCR的技術
摘要 已開發出一種新型的microrna mirna 的定量方法，即利用莖環反轉錄，taqman pcr分析。莖環rt引物在rt 效率和特異性方面比傳統的更好。taqman mirna的檢測是很具體的，可以檢測成熟mirna和區分相關的甚至低至乙個核苷酸的mirnas。此外，他們不會受到基因組dna...