第三次分子生物學實驗報告
1、通過酶切鑑定重組質粒的插入片段的大小；
2、學習並掌握pcr技術的原理和基本操作。
將含有外源dna的轉化子的菌株進行培養，並用試劑盒提取其質粒dna，將所提取的dna用切puc19質粒的同一種限制性內切酶進行切割以驗證所插入的外源dna的大小。
pcr（polymerase chain reaction）即聚合酶鏈式反應是1986 年由kallis mullis 發現。這項技術已廣泛地應用於分子生物學各個領域，它不僅可用於基因分離轉殖和核酸序列分析，還可用於突變體和重組體的構建，基因表達調控的研究，基因多型性的分析等方面。本次實驗旨在通過學習和掌握pcr反應的基本原理和實驗技術，以驗證重組質粒插入片段大小。
cr是一種利用兩種與相反鏈雜交並附著於靶dna兩側的寡核苷酸引物，經酶促合成特異的dna 片段的體外方法。反應過程由高溫變性，低溫退火和適溫延伸等幾步反應組成乙個迴圈，然後反覆進行，使目的的dna 得以迅速擴增。置待擴增dna 於高溫下解鏈成為單鏈dna 模板，人工合成的兩個寡核苷酸引物在低溫條件下分別與目的片段兩側的兩條鏈互補結合，dna聚合酶在72℃將單核苷酸從引物3'端開始摻入，沿模板5'—3'方向延伸，合成dna 新鏈。
由於每一迴圈所產生的dna均能成為下一次迴圈的模板，所以pcr 產物以指數方式增加，經25—30次週期之後，理論上可增加109倍，實際上可增加107倍。
pcr 技術具有操作簡便、省時、靈敏度高特異性強和對原始材料質量要求低等優點，但由於所用的taqdna 聚合酶缺乏5'—3'核酶外切酶活性，不能糾正反應中發生的錯誤核苷酸摻入，估計每9000個核苷酸會導致乙個摻入錯誤，但是錯誤摻入的鹼基有終止鏈延伸的作用傾向，使得錯誤不會擴大。
pcr技術類似於dna的天然複製過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。pcr由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：
①模板dna的變性：模板dna經加熱至93℃左右一定時間後，使模板dna雙鏈或經pcr擴增形成的雙鏈dna解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；
②模板dna與引物的退火(復性)：模板dna經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板dna單鏈的互補序列配對結合；
③引物的延伸：dna模板--引物結合物在taqdna聚合酶的作用下，以dntp為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留複製原理，合成一條新的與模板dna 鏈互補的半保留複製鏈重複迴圈變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的「半保留複製鏈」，而且這種新鏈又可成為下次迴圈的模板。
每完成乙個迴圈需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平台期(plateau)所需迴圈次數取決於樣品中模板的拷貝。
pcr的三個反應步驟反覆進行，使dna擴增量呈指數上公升。反應最終的dna 擴增量可用y＝(1＋x)n計算。y代表dn**段擴增後的拷貝數，x表示平（y）均每次的擴增效率，n代表迴圈次數。
平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反應中平均效率達不到理論值。反應初期，靶序列dn**段的增加呈指數形式，隨著pcr產物的逐漸積累，被擴增的dn**段不再呈指數增加，而進入線性增長期或靜止期，即出現「停滯效應」，這種效應稱平台期數、pcr擴增效率及dna聚合酶pcr的種類和活性及非特異性產物的競爭等因素。大多數情況下，平台期的到來是不可避免的。
pcr擴增產物可分為長產物片段和短產物片段兩部分。短產物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5』端之間，是需要擴增的特定片段。短產物片段和長產物片段是由於引物所結合的模板不一樣而形成的，以乙個原始模板為例，在第乙個反應週期中，以兩條互補的dna為模板，引物是從3』端開始延伸，其5』端是固定的，3』端則沒有固定的止點，長短不一，這就是長產物片段。
進入第二週期後，引物除與原始模板結合外，還要同新合成的鏈（即長產物片段）結合。引物在與新鏈結合時，由於新鏈模板的5』端序列是固定的，這就等於這次延伸的片段3』端被固定了止點，保證了新片段的起點和止點都限定於引物擴增序列以內、形成長短一致的短產物片段。短產物片段是按指數倍數增加，而長產物片段則以算術倍數增加，幾乎可以忽略不計。
這使得pcr的反應產物不需要再純化，就能保證足夠純dn**段供分析與檢測用。
在pcr反應體系中主要存在5類物質，即引物、酶、dntp、模板和mg2+。
引物是pcr特異性反應的關鍵，pcr 產物的特異性取決於引物與模板dna互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板dna序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用pcr就可將模板dna在體外大量擴增。
設計引物應遵循以下原則：
（a）引物長度：引物長度根據統計學計算，長約17個鹼基的寡核苷酸序列在基因組中可能出現的機率的為1次。因此，引物長度一般最低不少於16個核苷酸，而最高不超過30個核苷酸。
典型的引物18 到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，並降低序列存在於非目的序列位點的可能性。但是長度大於24 核苷的引物並不意味著更高的特異性。
較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。
（b）引物擴增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。
（c）引物鹼基：（g+c）含量以40-60%為宜，（g+c）太少擴增效果不佳，（g+c）過多易出現非特異條帶。a、t、g、c最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
（d）避免引物內部出現二級結構，尤其是髮夾結構。兩個引物之間不應發生互補，特別是在引物3』端，即使無法避免，其3』端互補鹼基也不應大於2個鹼基，否則易生成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。
（e）引物3'端的鹼基，特別是最末及倒數第二個鹼基，應嚴格要求配對，以避免因末端鹼基不配對而導致pcr失敗。
（f）引物中有或能加上合適的酶切位點。被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子轉殖很有好處。
（g）引物的特異性：引物應與核酸序列資料庫的其它序列無明顯同源性。引物量：
每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。
本次實驗所使用的上下游引物m13f、m13r分別與puc19多轉殖位點兩端的24bp長度的序列配對。puc19載體上兩引物之間的長度為150bp，因此目的擴增的片段長度=（多轉殖位點插入片段長度+150bp）。上下游引物的tm值分別為64.
7℃和57.9℃，相差達到6.7℃，基本符合引物設計要求。
taq dna聚合酶是從棲熱水生菌中提純的天然酶或是大腸菌合成的基因工程酶[3]。本次實驗催化pcr反應的酶量為0.05 u/μl，如果聚合酶的濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。
dntp的質量與濃度和pcr擴增效率有密切關係，在pcr反應中，dntp應為50～200umol/l（本次實驗為200μmol/l）。4種dntp的濃度應相等，如其中任何一種濃度不同於其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。如果4種dntp濃度過低會降低pcr產物的產量，而dntp濃度過高則會與mg2+結合，使游離的mg2+濃度降低。
模板的量與純化程度，是pcr成敗與否的關鍵環節之一，提取的核酸可直接作為模板用於pcr反應。模板的量應適中（本實驗為0.4 ng/μl），。
如果模板的量過低會降低pcr產物的產量，而模板的量過高則會與mg2+結合，使游離的mg2+濃度降低。另外，模板純化程度過低會產生非目的擴增產物。
mg2+濃度對pcr擴增的特異性和產量有顯著的影響，在pcr反應中， mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現非特異擴增，濃度過低會降低taq dna聚合酶的活性，使反應產物減少。
pcr反應條件為溫度、時間和迴圈次數。
基於pcr原理三步驟而設定變性、退火、延伸三個溫度點。在標準反應中採用三溫度點法，雙鏈dna在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火並結合到靶序列上，然後快速公升溫至70～75℃，在taq dna 聚合酶的作用下，使引物沿模板延伸。對於較短靶基因（長度為100～300bp時）可採用二溫度點法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般採用94℃變性，65℃左右退火與延伸。
（a）變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導致pcr失敗的最主要原因。一般情況下，93～94℃1min足以使模板dna變性，若低於93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環境對酶的活性有影響。
此步若不能使靶基因模板或pcr產物完全變性，就會導致pcr失敗。
（b）退火溫度與時間：退火溫度是影響pcr特異性的較重要因素。變性後溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發生結合。
由於模板dna 比引物複雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高於模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決於引物的長度、鹼基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對於20個核苷酸，（g+c）含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。
引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：
tm值(解鏈溫度)=4(g+c)＋2(a+t)
復性溫度=tm值-(5～10℃)
在tm值允許範圍內，選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合， 提高pcr反應的特異性。復性時間一般為30～60s，足以使引物與模板之間完全結合。
（c）延伸溫度與時間：taq dna聚合酶的生物學活性：
70～80℃ 150bp /s酶分子；
70℃ 60bp/s酶分子；
55℃ 24bp/s酶分子。
高於90℃時， dna合成幾乎不能進行。pcr反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利於引物和模板的結合。pcr延伸反應的時間，可根據待擴增片段的長度而定，一般1kb以內的dn**段，延伸時間1min是足夠的。
3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。
迴圈次數決定pcr擴增程度，pcr迴圈次數主要取決於模板dna的濃度。一般的迴圈次數選在20～40次之間，迴圈次數越多，模板、引物特異性下降，聚合酶的活性也會降低。因而非特異性產物的量隨之增多。
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