一、目的
1、了解微量凱氏定氮法測定蛋白質含量的基本原理。
2、掌握本試驗的操作步驟。
二、原理
1. 生物材料中含有許多含氮的有機物,如蛋白質、核酸、氨基酸等，故含氮量的測定在生化研究中十分重要。知道了含氮量，就可推知蛋白質量。
本法適於測定0.2～2.0毫克的氮。
2. 有機物與濃硫酸共熱,有機物轉變為氨，氨與硫酸作用生成硫酸銨,後者與強鹼作用釋放出氨,借蒸汽將氨蒸至硫酸液中和的濃度，即可計算出樣品的含氮量。
3. 本實驗用直接法來判斷中和程度。用硼酸作為氨的吸收溶液，結果使溶液中氫離子降低，混合指示劑(ph4.
3～ph5.4)由黑紫色變成綠色。再用標準酸來滴定,使硼酸恢復到原來的氫離子的濃度為止,指示劑出現淡紫色終點,此時所耗的鹽酸量為氨的量。
nh3+h3bo4 → nh4h2bo4 nh4h2bo4+hcl —→ nh4cl+h3bo4
4. 為了加速消化，可加入cuso4作催化劑，硫酸鉀或硫酸鈉可提高溶液的沸點。此外硒汞混合物或鉬酸鈉可作為催化劑，且縮短作用時間，h2o2也可加速反應。
三、試劑和器材
1、試劑的配製
（1）樣液 7.5g蛋清溶於0.9% nacl液,並以生理鹽水稀釋至100ml。如有不溶物，離心取上清備用，即為7.50%的雞蛋清溶液。
（2）30% 氫氧化鈉溶液
（3）2% 硼酸溶液
（4）混合指示劑
（5）1mol/l標準鹽酸溶液
2、材料
硫酸（硫酸鉀：硫酸銅=3：1（w：w）混勻研成粉末、凱氏定氮管、凱氏定氮儀。
四、操作
1、消化
每人1支凱氏定氮管編號，第1、2組加1.0ml蒸餾水作為空白對照，其他各組加1.0ml雞蛋清樣液。
然後加硫酸鉀-硫酸銅混合物約20mg及濃硫酸2ml，並放入3-4粒玻璃珠，放在消化爐上加熱消化。開始時應控制火力，將消化溫度控制在150℃5 min，然後再增加至200℃，消化10 min。注意勿使瓶內液體衝至瓶頸。
待瓶內水汽蒸完，硫酸開始分解釋放出so2白煙後，適當加強火力至300℃消化10 min，然後增加火力至450℃，直至消化液透明並呈淡綠色為止（1.5-2 h），冷卻，準備蒸餾。
2、蒸餾
每人取50-100ml錐瓶1個，先按一般方法洗淨，再用蒸汽洗滌3次，每次15-20s，冷卻，用吸管各加入2%硼酸溶液5.0ml及指示劑2-3滴。如瓶內液體呈葡萄紫色，蓋好備用。
如錐形瓶內液體呈綠色，需要蒸汽重新洗滌。
將裝有消化液的消化管，加入定氮儀左邊反應室，再在冷凝管下置一盛有硼酸液及指示劑的錐形瓶，並使冷凝管口插入酸液面下約0.5 cm處。
開啟鹼開關，通入10-15ml的30%naoh溶液，讓naoh液緩緩流入反應室內的消化管中。關掉通鹼開關，開啟通氣閥開始蒸餾。開始蒸餾後，即應注意硼酸溶液顏色的變化。
當酸液由葡萄紫色變成綠色後，再蒸餾20s，若綠色不變，降低錐形瓶，使冷凝管口離開酸液液面約1cm，再通氣數秒鐘（讓凝管口上的溶液進入錐形瓶）後關掉通氣閥，移去錐形瓶，蓋好，準備滴定。
3、滴定
用0.01mol/l的hcl溶液滴定錐形瓶中的硼酸溶液至淺葡萄紫色，記錄所耗hcl溶液的量。
4、計算
蛋白量=(a-b)×10-3×m×14.008×6.25 ×100/7.5
即為每g雞蛋清中所含的蛋白質的量
a=滴定樣品用去的hcl液ml數； b=滴定空白用去的hcl液ml數；
m=滴定所用鹽酸的摩爾濃度； 14.008=氮之原子量。
附：一些常見食物的產氨量
各種食物含氮量
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