人IFN ELISpot指導方針

2022-10-01 15:48:11 字數 735 閱讀 6895

人ifn-γelispotpbo指導方針

a.準備工作和封閉預包被孔板

1、在支架上安裝需要數量的孔條,用無菌pbs (200 μl/孔)洗4次。剩餘的孔條放在封閉袋中室溫儲存。

2、用包含10 %血清(血清與懸浮細胞的血清相同)的培養基(200 μl/孔)封閉。在室溫下孵育至少30分鐘。

b.在孔板中孵育細胞

1、移去封閉培養基,加入包含有像抗原等可能的刺激因素的細胞懸液(終體積100~150 μl/孔)。推薦使用試劑盒中的細胞因子產物mab cd3-2做為陽性對照,使用終濃度為100 ng/ml。

2、孔板放在37℃、5% co2的增濕培養箱中賦予12~48 h。孵育的時候不要移動孔板,使用鋁箔紙包裹孔板以避免水分蒸發。

c、檢測斑點

1、排空孔板移除細胞,用無菌pbs清洗5次,200 μl/孔。

2、用包含0.5 %胎牛血清的無菌pbs按照1:200稀釋一步反應檢測試劑(鹼性磷酸酶-結合的檢測mab 7-b6-1)。每孔加100 μl。室溫孵育2 h。

3、200 μl/孔pbs清洗孔板5次。

4、用0.45 μm的濾膜過濾準備使用的底物裂解液(bcip/nbt-plus),每孔加100 μl。顯像直到斑點出現;超過15 min的顯影能引起背景染色。

用自來水沖洗使染色反應終止。移去板縫裡面的水(孔板下面的軟塑料)並且清洗薄膜的背面。

5、晾乾孔板。在顯微鏡(x40)或者在elispot計數器上檢查並計數斑點。

6、室溫暗處儲存孔板。

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