碳源及碳氮比對異養反硝化微生物異養反硝化作用的影響
碳源及碳氮比對異養反硝化微生物異養反
硝化作用的影響
農村生態環境2005,21(2):42—45ruraleco—environment 碳源及碳氮比對異養反硝化微生物異養反硝化作用的影響
傅利劍,郭丹釗,史春龍,黃為一(南京農業大學生命科學學院微生物學系/農業部農業環境微生物工程重點開放
實驗室,江蘇南京210095)
摘要:碳源(甘油和檸檬酸鈉)及碳氮比對純培養的異養反硝化菌hp1(異養反硝化能力
影響的試驗表明,碳源種類對硝酸還原酶活性沒有明顯影響,對氧化亞氮還原酶活性有影響.批式培養方式下最
適c/n為8,菌株hp1可以利用no;作為唯一氮源進行反硝化作用,證明hp1至少有2種硝酸還原途徑.連續
培養方式下溫度對菌株hp1異養反硝化作用中間產物的積累有影響,不同c/n時均有nh積累,c/n為3時還
有no;的積累.
關鍵詞:異養反硝化微生物;反硝化作用;碳源;c/n
中圖分類號:x172;q935文獻標識碼:a文章編號:
1001—5906(2005)02—0042—04 e岱ectofcarbonsourceandc/厶0n,guodan—zhao,
shlchun—longhuangwei—yi0departmentofmicrobiology,collegeoflifesciences,nanjingagriculturaluniversity/
key,ministryofagric
ulture,nanjing210095,china). ruraleco—environment,20hd5,21(2):42—45
abstract:.
atestwascarriedouttode—
termineeffectsofcarbonsourceandc/
effectonnitratereductaseactivity,butobviouseffectonnitrousoxidereductaseactivity,theoptimalc/nratiowas8in
batchdenitrificationtests,andwithc/nratiosbeing<8or>8,then2oconcentrationwaslowerundertheconditionofa—
.itwasconfirmedthat
,andstrainhp1hadtwokindsofnitrate
reductaseatleast./
nitriteaccumulatedatc/nratioof20,,
keywords:heterotrophicdenitrifier;denitrification;carbonsource;c/nratio 反硝化作用是地球氮迴圈過程中乙個重要的生
物過程.它是在厭氧條件下,反硝化微生物利用氮
氧化物作為電子受體,最終轉化成氮氣的生物過
程j.由於這個生物學性質,反硝化作用在富營養
化湖?白防治,高硝酸鹽含量地下水治理和工業廢水
處理中已受到越來越多的重視,'..
對某一特定的菌株而言,進行完整的反硝化作
用是非常複雜的過程,包括一系列的還原反應和電
子傳遞,受許多環境因素的影響,諸如o,溫度,
ph值,碳源(同時為異養反硝化微生物的電子供
體),c/n(指碳源碳與硝態氮的摩爾比值,全文相
同)等.各因素對微生物反硝化作用的影響是從不同方面體現出來的,有的影響酶的合成,有的影響酶的活性j.影響結果可從中間產物或終產物的形態,數量以及酶的合成情況上表現出來.
目前, 國內對純培養反硝化微生物的研究較少,本文研究了異養反硝化微生物的代謝特徵,為高硝酸鹽含量地下水的治理提供科學依據.
1材料與方法
1.1試驗菌種
菌株hp1(pseudomonasalcaligenes),系南京農業大學/農業部農業環境微生物工程重點開放實驗室分離自富營養化湖泊底泥.
**專案:上海市科技興農重點攻關專案(農科攻字98第05—2
號) 收稿日期:2004—06—22
?通訊聯絡人
第2期傅利劍等:碳源及碳氮比對異養反硝化微生物異養反硝化作用的影響43
1.2培養基
1.2.1碳源測試培養基
以gihay培養基?中除碳源以外的其他成分作為基礎培養基.加入待測碳源(甘油或檸檬酸鈉), 最終碳濃度為50mol?
l,.配製厭氧培養基時1l 培養基中加入1ml1.0g?
l的刃天青指示劑和 0.3g半胱氨酸,在氮氣保護下配製並分裝到hun. gate試管中.
凡厭氧培養基,皆按此方法配製. 1.2.
2碳氮比測試培養基
批式培養測定:以甘油為碳源,設定甘油一c與 no3-一n的比值(摩爾比)分別為3:1,6:1,8:1,10:1,
20:1和50:1.
連續培養測定:以檸檬酸鈉為碳源, 設定檸檬酸鈉一c與no3--n的比值(摩爾比)分別為3:l,20:
1.流加培養基和批式培養基成分相同. no;為氮源培養液:
giltay培養基中不加天冬醯胺, 其他成分相同.
1.3試驗設計
檸檬酸鈉是分離菌株hp1所選用的碳源,對菌株hp1進行碳源種類試驗時,甘油處理組是所選碳源中反硝化作用最強的,所以在碳源測試中選用甘油和檸檬酸鈉2種碳源.按上述要求配製好培養基後接人活化菌株hp1,在25?下培養,定時取樣測定no3--n,no;-n,nh4+-n,加乙炔和不加乙炔時的n0.
為測試碳源種類對氧化亞氮還原酶活性的影響,分別設定了加乙炔和不加乙炔處理組.它的原理是溶解於溶液中的乙炔可抑制氧化亞氮還原酶,使反應產生的中間產物n0積累而不被進一步還原為n,對參與反硝化作用的其他酶沒有影響.通過比較2種處理n0的產量可以得出氧化亞氮還原酶的活性.
c/n試驗分別在批式和連 ?
g $越 蟶c 續培養條件下進行.批式培養選用甘油為碳源,而連續培養選用檸檬酸鈉為碳源,這是因為用甘油配製giltay培養基易產生沉澱,不利於連續培養的操作.
1.4方法
恆化器的執行:稀釋速率0.045h,,反應器置於設定溫度下培養.
no;測定採用柱還原法,no;測定採用苯磺酸-鹽酸一n一1.萘乙二氨比色法,nh;測定採用納氏試劑比色法測定採用氣相色譜法j.生物量的測定:
發酵液5ml, 10000r?min離心10min.取沉澱於105?
下烘至恒重,以未接菌的空白培養基作對照. 2結果與討論
2.1碳源對菌株hp1異養反硝化作用的影響碳源對菌株hp1異養反硝化作用的影響見圖 1.由圖1可知,hp1利用檸檬酸鈉或甘油為碳源, 在檢測時間段內均有一定量的no3-殘留,變化範圍在3.
92,5.08mg?l,.
no2積累量也無明顯區別,變化趨勢一致.以檸檬酸鈉為碳源時,no;平均值為3.92mg?
l,,以甘油為碳源時則為4.30 mg?l,.
2種碳源條件下,nh4+的積累呈現明顯不同的變化趨勢,n0濃度的變化也有較大差別. 在不加乙炔抑制時,檸檬酸鈉試驗組檢測不到n,0, 甘油試驗組在12h為0.8mg?
l,,隨後開始下降, 到18h為0.13mg?l,.
加乙炔抑制時,2處理組 n0濃度在前13h均呈上公升趨勢;在隨後的時間內,檸檬酸鈉試驗組開始下降,到15h趨於平穩, n0濃度為14.5mg?l,.
甘油試驗組則一直呈上公升趨勢,到18hn0濃度達24mg?l,. 】5】6】7】812l3141516l7l8 t/ht/h
十加乙炔n20;+不加乙炔n20;卜銨態氦;—矗一硝態氮;—*一亞硝態氮
圖1碳源對菌株hp1異養反硝化作用的影響
fig.1effectofcarbonsourceondenitrificationofstrain刪一_一g),越蟶ez
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農村生態環境第21卷
上述結果表明,碳源種類對硝酸還原酶沒有明顯影響,但對氧化亞氮還原酶有影響.甘油為碳源時氧化亞氮還原酶活性在試驗開始時較低,這表現在不加乙炔抑制時有n0被檢測出,而以檸檬酸鈉
甘油為碳源時,加乙炔處為碳源時無n,0的積累.
理組17h前n0濃度低於檸檬酸鈉為碳源時的濃度,至17h後n0濃度持續上公升,超過了檸檬酸鈉為碳源時的濃度.作為異養反硝化菌株hp1的電子供體,甘油比檸檬酸鈉的效果好.至於nh;的積累,可能是菌體自溶後釋放而來的,也可能是還原產生的.
在本試驗中,由於測試時間短,後一種可能性較大.
2.2批式培養時碳氮比對菌株hp1異養反硝化作用的影響
異養反硝化作用所需作為電子供體的碳源的計算公式為:
c(oc)=2.86c(no3一n)+1.71c(no;一n)+ c(do)(1)
式中,c(oc)所需有機碳濃度,mol?l,;c(no3-一 n):處理水中硝態氮濃度,mol?
l,;c(no2-一n):處理水中亞硝態氮濃度,mol?l'.
;c(do):處理水中溶解氧濃度,mol?l,.
由公式(1)可推導出在無氧條件下,反硝化作用所需碳與硝態氮和亞硝態氮之和的理論比值為4.6:1(摩爾比).
在異養微生物生長代謝過程中,有機碳除作電子供體外,還作為碳源營養物用來合成微生物生長所需物質而被消耗, 所以實際需要的有機碳量大於由公式(1)計算出的理論比值(4.6:1).
批式培養條件下碳氮比對菌株 hp1異養反硝化作用的影響見圖2,試驗結果符合上述推論.由圖2可知,c/n為3:1時碳源不足, n0濃度低於其他試驗組;當c/n為8:
1時,n:0濃度在各試驗組中最高;當c/n超過8:1時,n0濃度反而降低.
可見在批式培養時hp1培養的最適 c/n為8:1.
不同pH值條件下3種不同碳源釋碳效果的比較
江蘇農業科學 年第 卷第 期一 一 王冰冰，曹文平，張雁秋，等 不同 值條件下 種不同碳源釋碳效果的比較 江蘇農業科學 不同 值條件下 種不同碳源釋碳效果的比較 王冰冰 曹文平 張雁秋 許 強 中國礦業大學江蘇省資源環境資訊工程重點實驗室，江蘇徐州 徐州工程學院環境工程學院，江蘇徐州 摘要 通過靜態...
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