1．請簡述提取rna操作時的主要注意事項。
控制潛在的rna酶活性。低溫。所用器皿去rna酶。操作時避免rna酶汙染。
2． 藍白斑篩選原理.
藍白斑篩選是重組子篩選的一種方法，是根據載體的遺傳特徵篩選重組子，如α-互補、抗生素基因等。現在使用的許多載體都帶有乙個大腸桿菌的dna的短區段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacz）的調控序列和前146個氨基酸的編碼資訊。在這個編碼區中插入了乙個多轉殖位點（mcs），它並不破壞讀框，但可使少數幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用於可編碼β-半乳糖苷酶c端部分序列的宿主細胞。
因此，宿主和質粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時存在時，可形成具有酶學活性的蛋白質。這樣，lacz基因在缺少近操縱基因區段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區段的質粒之間實現了互補，稱為α-互補。由α-互補而產生的lacz+細菌在誘導劑iptg的作用下，在生色底物x-gal存在時產生藍色菌落，因而易於識別。
然而，當外源dna插入到質粒的多轉殖位點後，幾乎不可避免地導致無α-互補能力的氨基端片段，使得帶有重組質粒的細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍白斑篩選。如用藍白斑篩選則經連線產物轉化的鈣化菌平板37℃溫箱倒置培養12-16hr後，有重組質粒的細菌形成白色菌落。
4．用t載體轉殖pcr產物(t-a clonging)的原理是什麼?
taqdna聚合酶具末端轉移酶活性，故用taqdna聚合酶進行pcr反應，反應產物在其3』末端往往習慣性的帶上乙個腺嘌呤粘性末端（-a）,從而難以將該產物以平末端連線的方式直接轉殖到載體上；針對pcr產物的這一特點，將普通的質粒載體在其多轉殖位點上用一種限制性內切酶處理，獲得線形的平末端載體，再在該載體的基礎上用末端轉移酶給其3』末端加上乙個胸腺嘧啶粘性末端（-t），由此獲得的新型載體稱之為t載體；用t載體的3 』t與含pcr產物的3』a進行配對，而將pcr產物以粘末端連線的方式直接高效的轉殖到t載體上的過程稱之為t-a cloning。
5．pcr （聚合酶鏈式反應 ）: 是通過模擬體內 dna 複製的方式，在體外選擇性地將 dna 某個特殊區域擴增出來的技術。
請介紹一下pcr （聚合酶鏈式反應 ）的三個基本步驟？
(1) 變性(denature):目的雙鏈dn**段在94℃下解鏈;
(2) 退火(anneal):兩種寡核苷酸引物在適當溫度(50℃左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對;
(3) 延伸(extension):在taq dna聚合酶合成dna的最適溫度下,以目的dna為模板進行合成.
由這三個基本步驟組成一輪迴圈,理論上每一輪迴圈將使目的dna擴增一倍
請簡述pcr引物設計時需要遵循的原則。
(1) 引物長度約為16-30bp， 太短會降低退火溫度影響引物與模板配對，從而使非特異性增高。太長則比較浪費,且難以合成。 (2) 引物中g+c含量盡量控制在 40% 至 60% 之間， 4 種鹼基的分布應盡可能均勻。
盡量避免嘌呤或嘧啶的連續排列，以及 t 在 3『 末端的重複排列。(3) 四種鹼基應隨機分布，引物的 3『 末端最好是 g 或 c，但在3』端不存在連續3個g或c,因這樣易導致錯誤引發。(4)引物的解鏈溫度：
兩個引物之間的 tm 值差異最好在 2-5℃ 。
(5)避免引物內部或引物之間存在互補序列（3個鹼基），從而減少引物二聚體的形成以及引物內部二級結構的形成。
（6）引物5『端對擴增特異性影響不大, 可在引物設計時加上限制酶位點、核醣體結合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標記生物素、螢光素、地高辛等. 通常應在5』端限制酶位點外再加1-2個保護鹼基。 (7) 引物不與模板結合位點以外的序列互補。
所擴增產物本身無穩定的二級結構。
基因工程對載體的要求
1、分子較小，可攜帶比較大的ｄｎａ片段。 2、能獨立於染色體而進行自主複製並且是高效的複製。 3、要有盡可能多種限制酶的切割位點，但每一種限制酶又要最少的切割位點（多轉殖位點） 。
多轉殖位點，是含有多個限制酶的單識別位點的一段核苷酸序列.4、有適合的標記，易於選擇。 5、有時還要求載體要能啟動外源基因進行轉錄及表達，並且盡可能是高效的表達。
6、從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉移，僅限於在某些實驗室內特殊菌種內才可複製等等。
聚丙烯醯胺凝膠電泳
2. tae 含edta (ph8.0)和tris-乙酸的電泳緩衝液
3. edta 二乙胺四乙酸
4. tbe tris-硼酸和edta的電泳緩衝液
5. rnase a核糖核酸酶 a
6. dntp 脫氧核苷三磷酸
7. cdna 互補dna
8. dsdna 雙鏈dna
9. phagemid噬菌粒
10. yac 酵母人工染色體
11. pcr聚合酶鏈式反應
12. rf dna 複製型dna
13. bac 細菌人工染色體載體
14. ampr氨苄青黴素抗性基因
15. msc多轉殖位點
16. bap細菌的鹼性磷酸酶
17. cip牛小腸鹼性磷酸酶
18. ori 複製起點
19. bsa小牛血清蛋白
20. lacz β-半乳糖苷酶基
基因工程複習
第二章分子轉殖工具酶 基因工程工具酶 限制性內切酶 主要用於dna分子的特異切割 dna甲基化酶 用於dna分子的甲基化 核酸酶 用於dna和rna的非特異性切割 核酸聚合酶 用於dna和rna的合成 核酸連線酶 用於dna和rna的連線 核酸末端修飾酶 用於dna和rna的末端修飾 其它酶類 用於...
基因工程複習
第一章一 名詞解釋 1 基因工程 按工程學原理，將外源基因切割，與載體結合，匯入受體細胞，使其穩定表達的過程。2 目的基因 開發人們特殊需要的基因產物或與優良性狀相關的基因。3 工具酶 體外進行dna合成 切割 連線 修飾等過程需要的酶。4 dna藥物 在受體細胞內表達產物有藥理作用或通過定位整合直...
基因工程專題
專題九第1講 一 選擇題 1 我國科學工作者培育的轉基因抗蟲棉，其抗蟲基因 於 a 蘇雲金芽孢桿菌中的抗蟲基因 b 棉鈴蟲變異形成的致死基因 c 寄生在棉鈴蟲體內的線蟲基因 d 普通棉的突變基因 答案 a 解析 用於植物抗蟲基因工程研究的基因很多，但並不是所有的基因均可用於轉基因抗蟲棉的培育，而應根...