第二章 enzymes
第四節 dna連線酶ligase
一、dna連線酶的發現
二. 連線條件
必須是兩條雙鏈dna。
dna3』端有游離的-oh，5』端有乙個磷酸基團（p）。需要能量。
三、連線反應的機理
1、atp（nad+)提供啟用的amp。
2、atp與連線酶形成共價「連線酶-amp」複合物，並釋放出焦磷酸ppi。
3、amp與連線酶的賴氨酸 -氨基相連。
4、amp隨後從連線酶的賴氨酸 -氨基轉移到dna一條鏈的5』端p上，形成「dna-腺苷酸」複合物。
5、 3』-oh對磷原子作親核攻擊，形成磷酸二脂鍵，釋放出amp。
ligase：只連「nick切口」，不連「gap缺口」
四. 兩種 dna連線酶
1. e. coli dna ligase
**：適用：粘性末端（peg與高濃度一價陽離子存在可連平末端）
2. t4 ligase
**：t4 phage
適用：粘性末端及平末端
t4 vs.
t4 dna ligase製備容易，**便宜，能進行各種型別連線反應，應用更廣泛！
五.ligase的反應溫度
最佳溫度：
界於酶作用速率和末端結合速率之間，一般認為是4-15℃比較合適。
六. dna分子連線的四種形式
1. 粘性末端；2. 平末端；3. 平末端加尾；4. 平末端加銜接物(linker)或接頭(adaptor)
(1)digestion and ligation
1．粘性末端連線
problem: (自我環化作用)
解決方法：a、雙酶切（兩種內切酶）b、去磷酸
2.平末端連線
粘性末端連線效率高於平末端約100倍！
解決方法：化平末端為粘性末端
3. 平末端連線---同聚物加尾法
（1）末端脫氧核苷酸轉移酶
功能：5』至 3』單鏈聚合
作用特點：單鏈；無模版
作用機理：
a: 用5』-特異的核酸外切酶處理dna分子，以便移去少數幾個末端核苷酸, 獲得3』-oh的單鏈延伸末端。
b: 加入datp/dttp和末端脫氧核苷酸轉移酶組成的反應混合物中，dna分子的3-oh末端將會出現單純由poly(da)和poly(dt)組成的dna單鏈延伸。
c: 獲得poly(da)和poly(dt)尾巴，就會彼此連線起來。
缺點：當poly(da)，poly(dt)不嚴格等長時,重組dna分子會有缺口。
需要用dna聚合酶i填補，然後用dna連線酶連線最後的缺口。
4. 平末端連線
---銜接物連線法與接頭連線法
(1) 平末端的銜接物連線法
銜接物的5』末端和待轉殖的dn**段的5』 -末端，用多核苷酸激酶處理使之磷酸化。通過t4 dna連線酶的作用使兩者連線起來。用適當的限制酶消化具銜接物的dna分子和轉殖載體分子。
(2) 平末端的接頭連線法
將具有某種限制性酶(bamhi)粘性末端的典型dna接頭分子與平末端的dn**段連線後，後者變成具有粘性末端的dna分子。
七.熱穩定的dna連線酶——來自嗜熱高溫放線菌
熱穩定的dna連線酶的應用：
寡核苷酸連線測定法（oligonucleotide ligation assay, ola）
連線酶鏈式反應（ligation chain reaction, lcr）
寡核苷酸連線測定法的作用
檢測突變
寡核苷酸連線測定法的作用：檢測突變。
1. 寡核苷酸連線測定法
（1）原理:
兩條寡聚核苷酸探針分子，同一種與之互補變性的靶dna之間的雜交作用,這兩條寡聚核苷酸探針分子在靶dna分子上的位置是彼此相鄰的。
當他們同靶dna鏈是完全鹼基配對時，便可以被連線酶連線起來。
結合點或靠近結合點處存在和靶dna錯配的鹼基兩個探針之間不能形成磷酸二脂鍵。
第五節 dna聚合酶dna polymerase
常用的dna聚合酶：
1、大腸桿菌dna聚合酶ｉ
2、大腸桿菌dna聚合酶ｉ的klenow大片段酶
3、t4 dna聚合酶
4、t7 dna聚合酶
5、反轉錄酶等。
一、大腸桿菌dna聚合酶ⅰ
dna聚合酶ⅰ特點
活性： 5』 3』聚合低
5』 3』外切有
3』 5』外切低
dna聚合酶ⅰ的應用——放射性探針的標記
(1)dna聚合酶ⅰ的兩種特殊反應：
切口轉移與鏈取代
(2) 切口轉移法製備放射性dna分子雜交探針
二、klenow片段
1、dna聚合酶ⅰ的klenow片段
活性： 5』 3』聚合低
5』 3』外切無！
3』 5』外切低
2. klenow片段的應用
末端補平
末端標記及隨機引物標記
cdna第二鏈合成（見cdna文庫構建）
dna測序
三. t4 dna聚合酶
1. t4 dna聚合酶特點
活性： 5』 3』聚合低
5』 3』外切無
3』 5』外切高！
2.t4 dna聚合酶活性的條件
模版、引物、原料dntp
3. t4 dna 聚合酶的「取代合成」法末端標記
四. t7 dna聚合酶
1. t7 dna聚合酶特點
活性： 5』 3』聚合高！
5』 3』外切無
3』 5』外切高
2. t7 dna聚合酶的應用
合成：高活性，幾kb，不受dna二級結構的影響
標記：類似t4 （取代合成）
末端補平：類似t4
第六節核酸修飾酶
一. 修飾的 t7 dna聚合酶
活性： 5』 3』聚合更高(*3)！
5』 3』外切無
3』 5』外切無！
修飾的t7 dna聚合酶的應用：
合成能力：更高、更快、更強！
標記：重在「摻」與
末端補平：
二.激酶(kinase) & 磷酸酶(phosphotase)
t4 多核苷酸激酶
(1)特點
**：t4噬菌體pset基因編碼；
活性：5』-oh 加磷酸；
(2)t4 kinase 5』末端標記的機理
用酸性磷酸酶處理使其脫磷酸，使5『oh基國暴露，同多核苷酸激酶從r-p atp分子中轉移來的r-p基團鍵合，實現末端標記。
(3) t4 多核苷酸激酶的應用
a: 5』末端標記
b: 5』末端磷酸化
磷酸酶(1)特點
**：細菌鹼性磷酸酶（bacterial alkaline phosphotase，bap)，小牛腸鹼性磷酸酶（calf intestinal alkaline phosphotase, ciap)，小牛腸。
活性： 5』-p 去磷酸
(2) 磷酸酶作用機理
催化核酸分子脫掉5『－p，使dna分子5』－p轉化成5『－oh－－－脫磷酸作用。
這樣產生的5『－oh末端，為隨後在[r-p]atp和t4多核苷酸激酶的作用下，可以加上放射性的標記。
(3) 磷酸酶的應用
末端標記前處理
防止dna分子自身環化
(4) bap與ciap比較
熱穩定性（65℃） bap：active ciap：30min失活
第七節核酸外切酶
1. 核酸外（exonucleases）切酶
定義:一類從多核苷酸鏈的一端開始按序催化降解核苷酸的酶。
分類：單鏈的核酸外切酶
雙鏈的核酸外切酶
第八節核酸內切酶
1. s1核酸酶
(1) 特點：
活性：降解單鏈核酸（dna或rna）為單核苷酸；降解雙鏈核酸的單鏈區
(2) s1核酸酶的應用----rna分子的定位
2. bal31核酸酶
bal31核酸酶的三種活性：
（1）單鏈核酸內切
（2）雙鏈核酸外切
（3）雙鏈切口對應鏈
bal31核酸酶主要用途：
（1）誘發dna發生缺失突變
（2）定位測定dn**斷中限制性位點的分布
（3）研究超盤旋dna分子的二級結構
3. 其他核酸酶
外切核酸酶ⅲ（exonuclease ⅲ）：3』至5』外切
rna酶ⅰ(rnaseⅰ)：切割dna-rna雜合鏈中的rna
其他核酸酶:
外切核酸酶ⅲ（exonuclease ⅲ）：3』至5』外切
dna酶ⅰ（dnase ⅰ）：隨機切割ss & dsdna
rna酶ⅰ(rnase ⅰ)：切割dna-rna雜合鏈中的rna
第三章 techniques基因工程技術
outline
1、電泳
2、分子雜交
3、轉化與轉染
4、核酸測序
5、dna擴增---pcr
6、核酸-蛋白相互作用
第一節電泳
原理：通過電場的作用使帶電的大分子在電泳介質中運動。
目的：根據帶電分子的分子量、電荷及構型分離不同的分子（依據不同的凝膠體系）。
電泳的分類：
瓊脂糖凝膠電泳（agarose gel electrophoresis），
聚丙烯醯胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，page）
瓊脂糖凝膠電泳（agarose gel electrophoresis）
ds-dna
目的：分離不同長度的dn**段
a.確定dn**段的長度
b.確定dna的有無與多少
c.分析酶切產物
凝膠電泳的原理: 略
電泳步驟
第一步：制膠
第二步：樣品製備
第三步：點樣
第四步：跑電泳
第五步：紫外燈下檢測，拍照
第六步：資料處理
緩衝體系：
tae, ph 8.0, ~50 mm - tris, acetate, edta
tbe, ph 8.0, ~50 mm - tris, borate, edta
影響遷移率的因素：
凝膠的孔徑
電壓dn**段長度及結構
eb的影響
解析度影響因素：瓊脂糖濃度緩衝液或樣品的鹽離子濃度核酸上樣量電壓
聚丙烯醯胺凝膠電泳（poly-acrylamide gel electrophoresis，page ）
範圍：短片段解析度：1bp
型別：變性膠（長度）、
非變性膠（長度、構型）
變性膠：1、含尿素；2、dna樣品經甲醯胺與熱處理；3、電泳保持溫度。
agarose與 page的不同：
解析度操作
應用：rflp, aflp, dd-pcr, sequencing, primer extension, s1 mapping, rnase protection assay…
基因工程教學總結
資中二中羅魏 高中三年級學生具有抽象思維，但是仍然需要感性知識，形象知識作為支援，如果教學過程中，能夠用心設計一些實物，化抽象為具體，最大程度激發學生興趣，突出學生的主體地位，那無疑是教學的一大亮點。所以課堂教學設計的雙邊活動，一定要尊重學生的主體地位。本節課用科普知識匯入，吸引學生的注意力，激發學...
基因工程複習
第二章分子轉殖工具酶 基因工程工具酶 限制性內切酶 主要用於dna分子的特異切割 dna甲基化酶 用於dna分子的甲基化 核酸酶 用於dna和rna的非特異性切割 核酸聚合酶 用於dna和rna的合成 核酸連線酶 用於dna和rna的連線 核酸末端修飾酶 用於dna和rna的末端修飾 其它酶類 用於...
基因工程複習
第一章一 名詞解釋 1 基因工程 按工程學原理，將外源基因切割，與載體結合，匯入受體細胞，使其穩定表達的過程。2 目的基因 開發人們特殊需要的基因產物或與優良性狀相關的基因。3 工具酶 體外進行dna合成 切割 連線 修飾等過程需要的酶。4 dna藥物 在受體細胞內表達產物有藥理作用或通過定位整合直...