第二章分子轉殖工具酶
基因工程工具酶
限制性內切酶——主要用於dna分子的特異切割
dna甲基化酶——用於dna分子的甲基化
核酸酶——用於dna和rna的非特異性切割
核酸聚合酶——用於dna和rna的合成
核酸連線酶——用於dna和rna的連線
核酸末端修飾酶——用於dna和rna的末端修飾
其它酶類——用於生物細胞的破壁，轉化，核酸純化，檢測等。
第一節限制性核酸內切酶(restriction enzyme)
一、限制性內切酶的發現歷史
核酸酶：催化核酸酯鍵的水解
核酸外切酶：作用於核酸鏈的末端(3′或5 ′),逐個水解核苷酸。
核酸內切酶：從核酸分子內部切斷3′， 5′磷酸二酯鍵。
限制性核酸內切酶：在細菌細胞內存在的一類能識別並水解外源雙鏈dna的核酸內切酶。
1、細菌的限制——修飾現象
細菌的限制——修飾作用
發現細菌的限制（restriction）現象：寄主控制的專一性
phageλk
r-m 系統的作用:r-m 系統是細菌安內御外的積極措施。
保護自身的dna不受制；破壞外源dna使之迅速降解
細菌 r-m 系統的限制酶可以降解 dna，為避免自身 dna 的降解，細菌可以修飾（甲基化酶）自身 dna，未被修飾的外來 dna 則會被降解。 個別噬菌體在被降解之前已經發生了修飾，則可免予被降解。
限制性內切酶本是微生物細胞中用於專門水解外源dna的一類酶，其功能是避免外源dna的干擾或噬菌體的感染，是細胞中的一種防禦機制。由於r/m現象的發現使得核酸內切酶成為基因工程重要的工具酶。
2、限制性核酸內切酶的發現
限制性核酸內切酶(restriction endonuelease)
是一類能識別雙鏈dna中特殊核苷酸序列，並使每條鏈的乙個磷酸二酯鍵斷開的內脫氧核糖核酸酶(endo-deoxyribonuclease)。
它是可以將外來的dna切斷，即能夠限制異源dna的侵入並使之失去活力，但對自己的dna卻無損害作用，這樣可以保護細胞原有的遺傳資訊。由於這種切割作用是在dna分子內部進行的，故名限制性內切酶(簡稱限制酶)。
1968 linn 和 arber 從 b 中發現限制酶ⅰ
1970 **ith（美）在流感嗜血桿菌發現限制酶ⅱ
1978 w. arber，h. o.**ith，nathans 因發現限制性內切酶及對其功能研究的突出貢獻獲得諾貝爾獎金 。
限制性核酸內切酶（限制酶）：
在細胞內能夠識別雙鏈 dna 分子中的特定核苷酸序列，並對 dna 分子進行切割的一種酶。
功能：降解不同源 dna，而不降解同源dna。
3 、限制性核酸內切酶的命名
若種名頭2個字母相同則其中乙個可用種名的第一和第三個字母。
限制酶的命名是根據細菌種類而定，以ecori為例：
4、限制與修飾系統的種類
ⅰ型限制酶（無用）
2023年，m.meselson和r.yuan在和中分離出的核酸內切酶。
1 分子量：30萬dal左右
2 組成：3種亞基
a. 特異性亞基：具特異性識別dna序列的特性。
b. 修飾亞基：具甲基化酶活性。
c. 限制亞基：具核酸內切酶活性。
3 輔助因子：需mg2+、atp和sam。
4 識別和切割位點：不一致（距識別位點5』一側數千鹼基處隨機切割dna分子）。
ⅱ型限制酶（十分有用）
2023年，h.o.**ith和k.w.wilcox在流感嗜血rd株中分離出來的限制酶。
1 分子量：2萬～10萬dal（較小）
2 組成：一種多肽，常以同源二聚體形式存在。
3 輔助因子：無需輔助因子，或只需mg2+。
4 識別和切割位點：相一致。
ⅲ型限制酶（無用）
1 組成：兩個亞基
a. m亞基：負責位點的識別與修飾。
b. r亞基：具核酸酶的活性。
2 輔助因子：需mg2+、atp和sam
3 識別和切割位點：不一致（距識別位點一側約25bp處切割dna分子）。
二、限制性核酸內切酶識別的序列
絕大多數的ⅱ型限制性核酸內切酶都能夠識別由4-8個核苷酸組成的特定的核苷酸序列。
限制性核酸內切酶就是從其識別序列內切割dna分子的，因此這些識別序列又叫核酸內切酶的切割位點或靶序列。
在 dna 分子雙鏈的特異性識別序列部位，切割 dna 分子，產生鏈的斷裂。
2 個單鏈斷裂部位在 dna 分子上的分布，通常不是彼此直接相對。斷裂結果形成的 dna 片段，具有互補的單鏈延伸末端。
1、限制酶識別序列的長度 （限制酶識別序列的長度一般為4-8個鹼基，最常見的為 6個鹼基）
4 個鹼基識別位點：sau3aⅰ ↓gatc
5 個鹼基識別位點：ecorⅱ ↓ccwgg
nciⅰ cc↓sgg
6 個鹼基識別位點：
ecorⅰ g↓aattc
hindⅲ a↓agctt
7 個鹼基識別位點：
bbvcⅰ cc↓tcagc
ppumⅰ rg↓gwccy
8 個鹼基識別位點：
notⅰ gc↓ggccgc
sfiⅰ ggc**nnn↓nggcc
當識別序列為 4 個和 6 個鹼基時，它們可識別的序列在完全隨機的情況下，平均每 256 個和 4096 個鹼基中會出現乙個識別位點（44=256，46=4096）。
限制性內切核酸酶
2、限制酶識別序列的結構
ii 型限制性核酸內切酶的基本特性
識別雙鏈dna分子中4 - 8對鹼基的特定序列大部分酶的切割位點在識別序列內部或兩側識別切割序列呈典型的旋轉對稱型回文結構。
ⅱ類酶識別序列特點—— 回文結構(palindrome)
切口 ：平端切口、粘端切口
3、限制酶切割的位置
dna在限制性核酸內切酶的作用下，使多聚核苷酸鏈上磷酸二酯鍵斷開的位置被稱為切割位點，用↓或／表示。
切割的位點：一般在識別序列內部，如g↓gatcc、at↓cgat、gtc↓gac、ccgc↓gg、agcgc↓t等。
少數在識別序列的兩側，如↓gatc、catg↓、↓ccagg等
三、限制酶產生的末端
1、限制酶產生匹配粘端
若在對稱軸 5′側切割底物， dna 雙鏈交錯斷開產生 5′突出粘性末端。
5′－gaattc－3′ ecorl 5′－g－oh p－aattc－ 3′
3『—cttaag－5』 3『—cttaa－p + oh－g－5'
若在 3『-側切割，則產生 3』 突出粘性末端，如 pstⅰ：
5'—ctgcag－3' pstl 5'—ctgca- 3' 5'—g－3'
3'－gacgtc- 53'—g- 5' 十 3'-acgt－5'
2、限制酶產生平末端
在回文對稱軸上同時切割 dna 的兩條鏈，則產生平末端，如 haeⅲ（gg↓cc）和 ecorv（gat↓atc）。
3、限制酶產生非對稱突出末端
許多限制酶切割dna產生非對稱突出末端。當識別序列為非對稱序列時，切割的dna產物的末端是不同的，如 bbcⅰ,它的識別切割位點如：cc↓tcagc
ggagt cg
1. s1核酸酶
(1) 特點：
活性：降解單鏈核酸（dna或rna）為單核苷酸；降解雙鏈核酸的單鏈區
(2) s1核酸酶的應用----rna分子的定位
2. bal31核酸酶
bal31核酸酶的三種活性：
（1）單鏈核酸內切
（2）雙鏈核酸外切
（3）雙鏈切口對應鏈
bal31核酸酶主要用途：
（1）誘發dna發生缺失突變
（2）定位測定dn**斷中限制性位點的分布
（3）研究超盤旋dna分子的二級結構
3. 其他核酸酶
外切核酸酶ⅲ（exonuclease ⅲ）：3』至5』外切
rna酶ⅰ(rnaseⅰ)：切割dna-rna雜合鏈中的rna
其他核酸酶:
外切核酸酶ⅲ（exonuclease ⅲ）：3』至5』外切
dna酶ⅰ（dnase ⅰ）：隨機切割ss & dsdna
rna酶ⅰ(rnase ⅰ)：切割dna-rna雜合鏈中的rna
4、同裂酶（**不同的限制酶識別相同的核苷酸靶序列）
同序同切酶、同序異切酶、同功多位等。
同序同切酶
5、同尾酶
**不同，識別的核苷酸靶序列也不相同，但切割後 dna 分子產生的粘性末端相同的限制性核酸內切酶。
bamhⅰ bclⅰ bglⅱ三種酶可產生相同的 5』gatc 粘性末端（配伍末端），由這種同尾酶產生的 dna 片段可因粘性末端的互補而彼此再連線起來。
四、dna末端長度對限制酶切割的影響
限制酶切割dna時對識別序列兩端的非識別序列有長度的要求，也就是說在識別序列兩端必須有一定數量的核苷酸，否則限制酶難以發揮切割活性。
限制性核酸內切酶的活性單位
20μl buffer 中，含1μg 底物 dna，於最適反應條件和溫度下，保溫 1 小時，能使 1μg dna 完全降解所需的酶蛋白量即為乙個酶單位，用 u 表示。
五、位點偏愛（site preference）
對不同位置的同乙個識別序列表現出不同的切割效率的現象稱作位點偏愛。
六、酶切反應條件
酶切反應系統應組成： 酶、底物和反應緩衝液，並且還需要合適的反應溫度。
1、緩衝液：常規緩衝液一般包括提供穩定ph的緩衝劑、 mg2+、牛血清蛋白 (bsa)、二硫蘇糖醇(dtt)。
2、反應溫度：大多數酶的標準反應溫度 37度。
3、反應時間：通常是1小時或更多，許多酶延長反應時間可減少酶量。
4、終止酶切的方法：edta可螯合mg2+，從而可終止酶切反應；加熱。
七、星星活性 （ star activity ）
限制性內切酶識別特異性放寬
ecorⅰ在正常情況下識別 gaattc 序列發生切割，但如果緩衝液中甘油濃度超過 5%，其識別位點發生鬆動，可在 aatt 處發生切割，ecorⅰ這種特殊的識別能力叫做星星活性，用 ecorⅰ*表示。
基因工程複習
第一章一 名詞解釋 1 基因工程 按工程學原理，將外源基因切割，與載體結合，匯入受體細胞，使其穩定表達的過程。2 目的基因 開發人們特殊需要的基因產物或與優良性狀相關的基因。3 工具酶 體外進行dna合成 切割 連線 修飾等過程需要的酶。4 dna藥物 在受體細胞內表達產物有藥理作用或通過定位整合直...
A基因工程複習題
一 單項選擇題 每題1分，共40題，共4 0分 1 基因工程誕生於 年。a 1972b 1973 c 1971d 1978 2 基因工程操作的三大基本元件是 i 基因 供體 ii 受體 iii 載體 iv 抗體 v 配體 i ii iiii iii iv ii iii ivii iv v 3 第乙個...
基因工程專題
專題九第1講 一 選擇題 1 我國科學工作者培育的轉基因抗蟲棉，其抗蟲基因 於 a 蘇雲金芽孢桿菌中的抗蟲基因 b 棉鈴蟲變異形成的致死基因 c 寄生在棉鈴蟲體內的線蟲基因 d 普通棉的突變基因 答案 a 解析 用於植物抗蟲基因工程研究的基因很多，但並不是所有的基因均可用於轉基因抗蟲棉的培育，而應根...