第一章緒論
基因工程概念：按照人們的願望，進行嚴密的設計，通過體外dna重組和轉基因等技術，有目的地改造生物種性。，使現有的物種在較短時間內趨於完善，創造出更符合人們需求的新的生物型別。
（又稱遺傳工程或dna重組技術）
（一）基因工程研究發展史
現代分子生物領域理論上的三大發現：1.dna是遺傳物質2揭示了dna分子的雙螺旋結構和半保留複製3遺傳密碼的破譯、遺傳資訊的傳遞方式。
現代分子生物領域理論上的三大發明：1.。
（2）基因工程研究內容
1目的基因的研究獲得目的基因的途徑很多，主要有通過構建基因組文庫或cdna文庫，從中篩選出特殊需要的基因。
2基因工程工具酶的研究基因工程工具酶指體外進行dna合成、切割、修飾和連線等系列過程中所需要的酶，包括dna連線酶、限制性核酸內切酶、修飾酶和連線酶等。現在常用的dna連線酶只有兩種，即大腸桿菌dna連線酶和t4dna連線酶。
第二章基因工程基本技術路線
基因工程基本技術路線圖
（一）dna的組成和結構
生物體內的dna絕大部分是以b-dna形式存在的。
當變性的dna迅速降溫時，兩條單鏈dna不易復性成雙鏈dna。
幾乎所有真核生物的染色體dna都是線性dna，部分原核生物的染色體dna也是以線形存在。
ocdna ldna ccdna(電泳方向：由上至下)
（二）天然dna的製備
1天然dna的**：1染色體dna 2病毒和噬菌體dna 3質粒dna 4線綠體和葉綠體dna
2天然dna的提取：1準備生物材料 2裂解細胞：對於細胞結構簡單的原核生物，可用溶菌酶處理，用naoh和sds處理，用煮沸處理，用冰凍處理，以及用超聲波處理等。
3dna的純化：
最常用的是方法是乙醇沉澱
4 dna濃縮：
5 dn**段大小的凝膠電泳檢測
影響電泳的因素：1帶點泳顆粒的物理性狀2支援物介質3電場強度4緩衝液離心強度
凝膠電泳：在ph8..0--8.
3的緩衝溶液中，核酸分子帶負電，向正極移動。在濃度適當的凝膠中，由於分子刷選效應，使大小和構想不同的核酸分子遷移率出現差異，從而把它們分開。
6核酸分子雜交（297-312）
7dna序列分析
（1）dna的雙脫氧鏈終止序列（329）
（2）化學降解測序列（327）
（3）pcr測序
（4）dna自動化測序
（5）dna雜交測序
（6）dn**段序列測序的策略隨機轉殖策略、引物步移策略和定向缺失轉殖策略。
大規模基因測序的兩種策略：逐步轉殖法和全基因組散彈法
第三章基因工程的酶學基礎
（一）限制性核酸內切酶和dn**段化
1限制性核酸內切酶是一類能識別雙鏈dna中特殊核苷酸序列，並使每條鏈的乙個磷酸二酯鍵斷開的內脫氧核糖核酸酶。
2限制性內切酶識別序列：（1）長度，4--8個鹼基，最常見的為6個鹼基。（2）識別序列的結構：
大多數為回文結構，切割位點在dna兩條鏈相對稱的位置，也有序列埠對稱的，或呈間斷對稱。（3）切割位點：磷酸二酯鍵斷開的位置。
3限制性內切酶內切產生的末端：（1）匹配末端：識別位點為回文對稱結構的序列經限制酶切割後產生的末端，亦即黏性末端。
（2）平末端：在回文對稱軸上同時切割dna的兩條鏈則產生的末端。（3）非對稱突出末端：
識別序列為非對稱性時。
4影響限制性內切酶活性的因素：（1）dna純度：存在pro、乙醇、edta、sds等等會降低活性，可增加酶的用量。
（2）dna樣品的甲基化程度。甲基化對酶切得影響：a修飾酶切位點b產生新的酶切位點c對基因組作圖的影響。
（3）限制性內切酶緩衝液的性質：高鹽、中鹽和低鹽。（4）dna的分子結構：
線形》超螺旋和環狀。（5）酶切溫度t：37°
5一些限制性核酸內切酶雖然**不同，但是具有相同的識別序列，這樣的限制性核酸內切酶被稱為同裂酶。同裂酶可以是具有不同的切割位點，也可以是具有相同的切割為點。
6 star活性：某些限制性核酸內切酶在特定條件下，可以在不是原來的識別序列處切割dna。
star活性出現的頻率因採用的限制性核酸內切酶、底物dna和反應條件的不同而不同。幾乎所有的限制性核酸內切酶都具有star活性。
7 dna分子片段化：（1）單酶切法（最常用的方法） （2）雙酶切法 （3）部分酶切
8 dna分子的限制性圖譜：（1）雙酶切法（2）部分酶切法（3）bal 31 逐步切割片段法
（二）dna連線酶
1 dna連線酶是一種封閉dna鏈上缺口酶，借助atp或nad水解提供的能量催化dna鏈的5'-po4與另一dna鏈的3'-oh生成磷酸二酯鍵。但這兩條鏈必須是與同一條互補鏈配對結合的(t4dna連線酶除外)，而且必須是兩條緊鄰dna鏈才能被dna連線酶催化成磷酸二酯鍵。
2 dna連線酶包括大腸桿菌dna連線酶和t4噬菌體dna連線酶。
3 t4噬菌體dna連線酶更廣泛的應用：（1）修復雙鏈dna上的單鏈缺口（2）連線rna-dna雜交雙鏈上的dna鏈缺口或rna鏈缺口，後者反應速度較慢。（3）連線酶完全斷開的兩個平頭雙鏈dna分子，屬於分子間連線，但速度慢，需高濃度的底物和酶。
4 dn**段的連線：（1）具互補黏性末端片段之間的連線（注意連線前後識別序列的變化）（2）具平末端dn**段的連線（3）dn**段末端修飾後再進行連線（4）dn**段加連桿後連線。
（三）甲基化酶
dam甲基化酶：修飾gatc序列中的腺嘌呤殘基成為5』-甲基腺嘌呤。
dcm甲基化酶：修飾cc(a/t)gg序列中的胞嘧啶殘基成為5』-甲基胞嘧啶。
（四）其他酶
1 磷性磷酸酯酶
2 dna聚合酶（1）大腸桿菌聚合酶（2）t4噬菌體dna聚合酶（3）tt噬菌體dna聚合酶（4）耐高溫dna聚合酶：主要用於多聚酶鏈式反應（pcr）（5）反轉錄酶：
依賴於rna的dna聚合酶。（6）末端脫氧核苷酸轉移酶
第四章基因工程載體
（一）載體的功能與特徵
1 概念：載體是在基因工程中，把外源dna或基因攜帶入宿主細胞的工具稱為載體。
2 功能：（1）運送外源基因高效轉入受體細胞
（2）為外源基因提供複製能力或整合能力
（3）為外源基因擴增和表達提供條件
3 載體藍本：天然存在的質粒，噬菌體，病毒dna，對其再進行修飾、改造、構建成多種功能的載體dna分子。
4 載體具備的條件：具有針對受體細胞的親緣性或親和性（可轉移性）
具有與特定受體細胞相適應的複製位點或整合位點
具有較高的外源dna裝載能力
具有多種單一的限制性內切酶的識別位點、切割位點
具有合適的刷選標記
載體的安全性
載體的本質是dna與外源基因連線匯入的受體細胞並能複製進行表達。
5 載體的分類：
根據**和性質分類：質粒載體、噬菌體載體、粘粒載體、噬菌粒載體、病毒載體、人工染色體載體。
根據功能和用途分類：轉殖載體、表達、測序、轉化、穿梭、多功能載體
（二）質粒載體
1質粒的基本特徵：自主複製、不相容性、可擴增、可轉移和不相容性。
質粒載體的三種共同成分：複製起點、刷選標記和轉殖位點（一般人工構建的質粒是單複製子）
2質粒載體的改造與構建：
天然質粒的侷限性
質粒載體必備條件：具有複製起始位點、抗性基因、多轉殖位點和較小的分子量（易於操作）和較高的拷貝數（可以獲得大量的轉殖基因）
質粒載體改造與構建的指導思想
常見質粒載體型別：轉殖質粒載體、表達質粒載體、多功能質粒載體和穿梭質粒載體。
藍白斑刷選原理
3 質粒dna的提取
4 質粒載體的穩定性
（3）λ噬菌體載體
1 λ噬菌體的生物學特性
2 λ噬菌體的構建（1）野生型λ噬菌體的侷限性（2）λ噬菌體的構建
3 λ噬菌體的主要型別：插入型取代型
4 λ-dna的提取
5 λ噬菌體載體的應用：基因文庫與cdna文庫的構建
6 λ噬菌體作為載體的優點：刷選方便提取方便
7 基因工程轉殖策略：分、切、接、轉、刷、增
8 λ噬菌體載體的轉殖步驟：（1）通過裂解過程增值載體
2）載體與外源dna的酶切（挑選目的基因）
3）載體與外源dna的連線
4）重組噬菌體的體外包裝
5）包裝噬菌體顆粒的感染
6）刷選
（四）粘性載體（柯斯質粒載體，co**id載體）
1co**id載體的構建：1978發明了柯斯質粒載體，具有cos位點的質粒
概念：是一類有人工構建的含有dna的cos序列和質粒複製子的特殊型別的質粒載體（複製起點、抗性標記、cos位點）具有λ噬菌體的高效感染能力和質粒易於轉殖的優點，有31-45kb的裝載能力。而且能夠被包裝成具有感染性能力的噬菌體顆粒。
2co**id載體的特點：（1）具有λ噬菌體的特徵，不形成溶菌週期（以大腸桿菌形式表現而不是噬菌斑）
2）具有質粒載體的特性
3）具有高容量的轉殖能力
3使用co**id轉殖載體的基本程式
co**id載體的缺點：（1）載體片段自我連線（2）外源dna的自我連線（3）多個本來不在一起的外源dna連線起來，同時插入與載體上。
（五）單鏈絲狀噬菌體載體
1生物學特性（1）外形呈絲狀（2）由外殼蛋白和正dna組成（3）全長6407個核苷酸（4）至少有10個基因
2 構建：p116
（六）人工染色體載體146-147
（七）噬菌體載體及其他病毒載體
基因工程複習
第二章分子轉殖工具酶 基因工程工具酶 限制性內切酶 主要用於dna分子的特異切割 dna甲基化酶 用於dna分子的甲基化 核酸酶 用於dna和rna的非特異性切割 核酸聚合酶 用於dna和rna的合成 核酸連線酶 用於dna和rna的連線 核酸末端修飾酶 用於dna和rna的末端修飾 其它酶類 用於...
基因工程複習
第一章一 名詞解釋 1 基因工程 按工程學原理，將外源基因切割，與載體結合，匯入受體細胞，使其穩定表達的過程。2 目的基因 開發人們特殊需要的基因產物或與優良性狀相關的基因。3 工具酶 體外進行dna合成 切割 連線 修飾等過程需要的酶。4 dna藥物 在受體細胞內表達產物有藥理作用或通過定位整合直...
基因工程專題
專題九第1講 一 選擇題 1 我國科學工作者培育的轉基因抗蟲棉，其抗蟲基因 於 a 蘇雲金芽孢桿菌中的抗蟲基因 b 棉鈴蟲變異形成的致死基因 c 寄生在棉鈴蟲體內的線蟲基因 d 普通棉的突變基因 答案 a 解析 用於植物抗蟲基因工程研究的基因很多，但並不是所有的基因均可用於轉基因抗蟲棉的培育，而應根...