hplc高效液相色譜
實驗目的：
了解液相色譜的發展歷史和最新進展。
熟悉液相色譜分離-紫外吸收檢測的基本原理和基本構造。
掌握高效液相色譜-紫外吸收檢測的操作步驟和分析方法，能夠通過液相色譜分離對目標物分析測定。
實驗原理
液相色譜利用液體作為流動相，物質在兩相中的吸附或分配係數的微小差異達到分離的目的。當兩相做相對位移時，被測物質在兩相間進行反覆多次的質量交換，使溶質間微小的性質差異產生放大的效果，達到分離和檢測的目的。液相色譜可用於分析低分子量，低沸點的有機化合物。
目前，液相色譜更多適用於中、高分子量，高沸點即熱穩定性差的有機化合物。
物質的吸收光譜本質是物質中的分子和原子吸收了入射光中特定波長的光能量，相應地發生了分子振動能級躍遷和電子能級躍遷的結果。由於各種物質具有不同的分子、原子和不同的分子空間結果，其吸收光能量的情況也就不一樣。因此，每種物質就有其特有的、固定的吸收光譜曲線，可根據吸收光譜上的某些特徵波長處的吸光度的高低判別或測定該物質的含量，這就是分光光度定性和定量分析的基礎。
分光光度分析就是根據物質的吸收光譜研究物質的成分、結構和物質間相互作用的有效手段。
物質在光的照射下會產生對光的吸收效應，而且物質對光的吸收式具有選擇性的。各種不同的物質都具有其各自的吸收光譜，因此不同波長的單色光通過溶液時其光的能量就會被不同程度的吸收，光能量大小的程度和物質的濃度有一定的比例關係，也就是紫外可見分光光度法的定量分析基礎朗伯-比爾（lambert-beer)定律，即物質在一定濃度的吸光度與它的吸收介質的厚度成正比。
實驗試劑
甲醇，丙酮，甲苯，甘油，鄰苯二甲酸二丁酯，混合樣品，未知樣品
實驗儀器
液相色譜儀，紫外分光光度計，蒸發光散射儀，電腦一台
實驗條件
流動相：甲醇：水=80:20/90:10 (v/v)
流速：1 ml/min
進樣量：1 μl
檢測波長：254 nm
蒸發光散射溫度：85 ℃
實驗步驟：
1. 首先檢查液相色譜的流動相，包含流動相的組成，流動相的量，流動相裡面是否有氣泡。新配製的流動相先超聲半小時以去除氣泡。
2. 開啟電源總開關，然後開啟儀器的電源，進行流動相排氣(purge)，同時檢查儀器是否正常執行，包含檢查是否有漏液，氣泡等。
3. 開啟電腦，待電腦啟動後，點選桌面的色譜軟體圖示，雙擊開啟軟體，以便啟動整個色譜系統。具體操作如下圖：
4.檢查儀器是否正常。3綠色代表正常，紅色為不正常。就緒代表可以進行下一步操作。
5：引數設定：開啟常規設定視窗對分析時間、檢測波長，lc幫浦中流動相比例和流速等進行設定，設定結束後點選download對設定進行儲存。
如下圖。選擇正常即圖中4，然後選擇lc停止時間設定為30 min, pda 接受時間為30 min, ad2 為30 min. 幫浦的總流速為1.
00ml/min, 幫浦b濃度為20%， 即甲醇濃度為80%。
6. 設定完成後，點選download進行儲存。
7. 點選單次分析即圖中8，同時選擇進樣的瓶號和進樣量，進樣量為1μl，即圖中9。然後樣品自動分析。
8. 樣品分析完以後，點選左側的資料分析進入資料後處理，對資料進行分析，右鍵選擇屬性，然後選擇rt，讀取蒸發光散射保留時間並記錄。
9.點選返回，然後如上述8操作，讀取13中的紫外吸收的保留時間。
10. 返回操作介面，更換流動相的比例90%，對樣品進行分析。觀察不同流動對被測物分離檢測的影響。
11. 實驗結束後，用流動相初步沖洗10min儀器後，將流動相改為純有機相，流動10-20min，然後停幫浦，關機並整理好試驗台。
實驗資料分析：
從實驗所得的圖來看實驗是否成功。如果成功，讀取相應的保留時間。將不同流動相組成下各色譜峰的保留時間、半峰寬、峰面積整理成表，計算分離度。
注意事項：
1. 操作時一定要按照儀器的操作規程。
2. 開幫浦前應檢查流路中的氣泡，應保持排除乾淨。
3. 色譜柱個體差異很大，因此色譜條件（主要是流動相配比）應根據所用色譜柱的實際情況做作適當的調整。
思考題：
1.改變流動相，樣品的分離度和保留時間是否會改變？
2.被測物質、流動相的極性對樣品分析的影響？
3.混合樣品中，物質出峰的順序？
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