一、液相色譜理論發展簡況
液相色譜實際是一種分離方法，就象以前所用的萃取、蒸餾、離心、過濾等等一樣。其分離原理是：溶於流動相(mobile phase)中的各組分經過固定相時，由於與固定相(stationary phase)發生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先後從固定相中流出。
又稱為色層法、層析法。
色譜法最早是由**植物學家茨維特（tswett）在2023年研究用碳酸鈣分離植物色素時採用的實驗方法。他將植物色素的石油醚提取液倒入裝有碳酸鈣的直立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下,結果色素中各組份互相分離形成各種不同顏色的譜帶（tswett）用希臘語chroma(色)和graphos(譜)描述他的實驗方法，即現在的chromatography(色譜法)，色譜法(chromatography)因之得名。
色譜法自20世紀30年代開始廣泛研究，發展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法，而高壓液相色譜法的廣泛應用則到20世紀70年代。
液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相，稱為經典液相色譜法，此方法柱效低、時間長（常有幾個小時）。高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，hplc)是在經典液相色譜法的基礎上，於60年代後期引入了氣相色譜理論而迅速發展起來的。它與經典液相色譜法的區別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜法(high pressure liquid chromatography，hplc)。
又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(high speed liquid chromatography，hslp)。也稱現代液相色譜。
介紹《超高效液相色譜（uplc）的應用》
二、hplc的特點
適用範圍寬：現在絕大部分化學類藥品皆可採用該儀器分析。
分離效率高：複方分析（提及一下紫外法測定複方成分的應用，如co.smz）、輔料干擾時（提及溶出度含量測定時，尤其是溶出量明顯大於含量時）等情況下，更顯示其威力。
速度快：在摸索色譜條件時，一般使主成分出峰時間在30min以內（太快可以，詳細說明）；但如為有關物質測定，當然是主成分與雜質分離為首要條件。這裡需要強調的是，通常採用流速為1.
0ml/min，柱溫30~40℃的測定條件。這裡指的是在新建立乙個分析方法時；但當實際應用時，是可以任意改變的。一般含量測定、溶出度可調整為出峰時間快一些，有關物質測定一般調整的慢一些，最好10~15min左右出鋒，採用25cm長的色譜柱為好(看柱效)，但出峰時間過長，又會使峰形變得較差，具體問題具體分析。
流速和柱溫均可適當改變，以適應測定的需要。如含量測定時，可適當加大流速（流速提高依柱壓而定）和提高柱溫（60℃以下沒問題）；柱溫和流速降低均可對分離效果產生一定的影響，但有限，僅在邊緣時起作用。分離度的調節，關鍵還是流動相的配比。
順便提及：同樣的測定條件，不同公司生產的色譜柱c18柱，出峰時間都有可能相差很大，測定結果也相差很大（尤其是有關物質的測定），這十分正常（處理方法後面詳細講解）。對一些較為特殊的柱子，質量標準中應詳細註明，否則無法重現（usp）。
國內雖做不到，但可在色譜條件上下工夫，以適應不同的色譜柱型號（列舉不同色譜柱測定結果不一致的例項），因為藥典本身規定流動相組成是可以調節的，即後面即將講到的《藥典液相色譜方法的調整》。
靈敏度高：可檢測物質達10-9g左右（即ng級），一般最低檢測濃度均可達10-1~10-3μg/ml（進樣體積10~20μl），因此，目前有關物質的測定方法最好選用hplc法，一者靈敏度高，二者可準確定量，易於穩定性考核的資料比較。這是紫外和薄層所無法匹敵的。
有些濃度非常低的，紫外檢測不到或者說紫外無法測定的，應用hplc儀器均可得到滿意的結果！如hplc的紫外檢測器也達不到測定「要求」，可通過加大進樣量，調節儀器靈敏度，或使用其他檢測器來解決。
色譜柱可反覆使用：一般使用、維護好，均可達2年以上。
流出的組分容易收集：可用於製備色譜或**極為昂貴的、量比較少的物質收集。
安全：僅是一些有機溶劑的汙染（使用時，流動相口要密封，一者避免揮發，使流動相中各組分比例不准，二者防止汙染環境），比氣相要安全的多。
還有乙個優點，就是成功率較高：一般條件確定好後，均可得滿意的結果，這也是與氣相、毛細管電泳比最大的優點（略帶一下氣相的知識介紹）。
自動化：現在自動進樣系統，普及很快，利用好可大大地提高工作效率。一些軟體的開發，也使計算大大地簡便
總之：高壓——壓力可達150~300 kg/cm2。色譜柱每公尺降壓為75 kg/cm2以上。
高速——流速為0.1~10.0 ml/min。通常分析乙個樣品在15~30 min，有些樣品甚至在5 min內即可完成。
高效——可達50000塔板每公尺。在一根柱中同時分離成份可達100種。
高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。
柱子可反覆使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。
解析度高——可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。
樣品量少，容易**——樣品經過色譜柱後不被破壞，可以收集單一組分或做製備。
缺點：**昂貴、維護費用高，目前此類儀器絕大部分還依賴進口。
三、色譜法分類
◎按分離的目的可分為：
「分析型液相色譜製備型液相色譜」
目的:得到資料-定性及定量分析得到純品-分離及純化
–靈敏度的要求化合物的穩定性
–樣品的複雜性樣品的複雜性
–樣品量的要求製備量的要求
–精度及準確度的要求純度的要求，及純度的鑑定
–容易使用方法的安全性
◎按兩相的物理狀態可分為：氣相色譜法(gc)和液相色譜法(lc)。
氣相色譜法適用於分離揮發性化合物。gc根據固定相不同又可分為氣固色譜法(gsc)和氣液色譜法(glc)，其中以（glc）應用最廣。
液相色譜法適用於分離低揮發性或非揮發性、熱穩定性差的物質。lc同樣可分為液固色譜法(lsc)和液液色譜法(llc)。此外還有超臨界流體色譜法(sfc)，它以超臨界流體（界於氣體和液體之間的一種物相）為流動相（常用co2），因其擴散係數大，能很快達到平衡，故分析時間短，特別適用於手性化合物的拆分。
◎按原理分為吸附色譜法(ac)、分配色譜法(dc)、離子（交換）色譜法(iec)、排阻色譜法(ec，又稱分子篩、凝膠過濾(gfc)、凝膠滲透色譜法(gpc此外還有毛細管電泳和毛細管電色譜、超臨界流體色譜（supercritical fluid chromatography, sfc）和親和色譜法（吸附色譜的發展）等）
◎按操作形式可分為：紙色譜法(pc)、薄層色譜法(tlc)、柱色譜法。又稱平面色譜、柱狀色譜等。
四、色譜分離原理
高效液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。（以上是常用的）
1． 液固色譜法(absorption chromatography)
固定相通常是活性矽膠、氧化鋁、活性炭、聚乙烯、聚醯胺等固體吸附劑，所以吸附色譜也稱液固吸附色譜。活性矽膠最常用。矽膠是一種多孔性物質, 粒度5~10μm,通過-o-si(-o-)-o-si(-o-)-o-結合而具有三維結構,表面具有矽羥基。
作吸附劑的矽膠需經加熱處理,除掉其表面吸附水,使之活化。按其孔徑分布分為表面多孔和全多孔兩類。矽膠既是吸附色譜最常用的固定相，也是分配色譜、離子色譜等色譜固定相的常用基質。
流動相通常是弱極性有機溶劑或非極性溶劑與極性溶劑的混合物，如正構烷烴（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等等。
矽羥基呈微酸性，易與氫結合，是吸附的活性點。流動相溶劑在吸附劑表面形成單分子或雙分子吸附層，當樣品分子進入色譜柱，樣品主要靠氫鍵結合力吸附到矽羥基上，與流動相分子競爭吸附點。樣品分子反覆地被吸附，又反覆地被流動相分子頂替解吸，隨著流動相的流動而在柱中向前移動。
因為不同的樣品分子在固定相表面的吸附能力不同，因而吸附-解吸的速度不同，各組分被洗脫的時間（保留時間）也就不同，使得各組分相互分離。
應用： 吸附色譜在早期的hplc中應用得最多，大多數用於非離子型化合物，離子型化合物易產生拖尾。現在，很多以前用吸附色譜分離的物質被更方便和更有效的化學鍵合相反相分配色譜所代替。
由於矽羥基活性點在矽膠表面常按一定幾何規律排列，因此吸附色譜用於結構異構體分離和族分離仍是最有效的方法。如農藥異構體分離、石油中烷、烯、芳烴的分離。
2．液液色譜法(partition chromatography)
使用將特定的液態物質塗於擔體表面，或化學鍵合於擔體表面而形成的固定相。分離原理是根據被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是乙個分配平衡過程。
塗佈式固定相應具有良好的惰性；流動相必須預先用固定相飽和，以減少固定相從擔體表面流失；溫度的變化和不同批號流動相的區別常引起柱子變化；另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集複雜化。由於塗佈式固定相很難避免固定液流失，現在已很少採用。現在多採用的是化學鍵合固定相，以化學鍵合的方法將功能分子結合到惰性載體上，固定相就不會溶解到流動相中去了。
a 極性鍵合固定相： 鍵合在載體表面的功能分子是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等極性基團的有機分子。b 非極性鍵合固定相：
鍵合在載體表面的功能分子是烷基、苯基等非極性有機分子。如最常用的ods（octa decyltrichloro silane）柱或c18柱就是最典型的代表，它是將十八烷基三氯矽烷通過化學反應與矽膠表面的矽羥基結合，在矽膠表面形成化學鍵合態的十八烷基，其極性很小。
驗證方案 HPLC
高效液相色譜儀 驗證方案 類別編號 部門 驗證委員會頁碼 共16頁，第1頁 版次 新訂替代 起草部門年月日 審核年月日 審閱會簽 驗證委員會 批准年月日 實施日期 年月日 影印數批准 分發至目錄1 概述3 2 驗證目的3 3 驗證依據及驗證範圍3 4 驗證工作小組3 5 驗證方案審批3 5.1驗證方...
HPLC實驗流程
1 準備工作 1.進樣小瓶 1 無水乙醇浸泡過夜 2 自來水沖洗8次以上，再用濾過的娃哈哈礦泉水清洗數次 3 8次 3 烘乾，待用。2.色譜級甲醇溶液 色譜級乙腈溶液及娃哈哈礦泉水用砂芯濾器過濾。注意 1 先過濾娃哈哈礦泉水 先用自來水清洗砂芯濾器，再用娃哈哈清洗砂芯濾器。水相濾膜 兩層，0.45u...
島津HPLC操作
hplc高效液相色譜 實驗目的 了解液相色譜的發展歷史和最新進展。熟悉液相色譜分離 紫外吸收檢測的基本原理和基本構造。掌握高效液相色譜 紫外吸收檢測的操作步驟和分析方法，能夠通過液相色譜分離對目標物分析測定。實驗原理 液相色譜利用液體作為流動相，物質在兩相中的吸附或分配係數的微小差異達到分離的目的。...