螢光光度法

2. 標準系列的配製

取10ml比色管6支，按下錶配製標準系列管：

3. 儀器除錯

1）接通儀器及電源開關，再開啟電腦及工作站。

2）取標準系列濃度最高管（5號管），固定螢光波長535nm，在350~500nm的波長範圍內，掃瞄不同激發波長下的螢光強度，得到以激發光波長為橫座標，螢光強度為縱座標的激發光譜，確定激發光波長λex。

3）固定激發光波長λex，在450~600nm的波長範圍內，掃瞄不同螢光波長下的螢光強度，得到以螢光的波長為橫座標，螢光強度為縱座標的螢光光譜，確定螢光波長λem。

4. 測定

1）在λex和λem固定的條件下，將搖勻後的標準系列管，按濃度由低到高依次倒入樣品池中，分別測出螢光強度並記錄填入下表中。以螢光強度為縱座標，濃度為橫座標繪製標準曲線。

2）相同條件下測定樣品液螢光強度，記為f樣。再在測定過的樣品液中加入保險粉約10~20mg，輕輕搖動後迅速倒入樣品池中，測定螢光強度，記為f空白（30秒鐘之內測完）。

以f樣-f空白值在標準曲線上查出相應的維生素b2濃度。

3）測試完畢後，關閉電腦及工作站，再關閉儀器及電源開關。

五注意事項

1. 連二亞硫酸鈉能將螢光型維生素b2還原為非螢光型維生素b2，但不可多加，否則將其它還原性物質還原使測定結果偏高。同時，加入保險粉後應立即測定螢光強度，否則維生素b2又被氧化為螢光性，且多加或長時間後溶液會出現沉澱。

2. 為防止維生素b2見光分解，實驗應注意避光。

3. 螢光測定中的樣品池為四面皆光面的方形石英玻璃池，為防止汙染，應手持不在光路的邊稜。

六思考題

1. 為什麼要選用標準系列濃度最高管除錯儀器？

2. 是否能用螢光計代替螢光分光光度計測定螢光光譜和激發光譜，為什麼？