2023年第9卷第4期甘肅環境研究與監測總第36期用分光光度法繪製標準曲線時應注意的問題
劉東梅(蘭州炭素廠環境監測站蘭州海石灣 730084)
摘要敘述了影響標準曲線質量的各種因素，並提出了提高標準曲線質量應注意的幾個問題。
關鍵詞標準曲線影響因素問題
1影響標準曲線質量的因素
1.1 單色光純度不夠〔1〕
光度法中要求在最大吸收峰處測定吸光度，因此要求光度計的有效譜帶寬度越窄越好，有利於獲得純度高的單色光，當單色光純度不夠，即有效譜帶寬度不夠窄時，測定的吸光度偏低，濃度越高，測得的吸光度偏低越多，致使標準曲線上端向下彎曲。
1.2溶質隨溶液濃度變化而出現電離、解離或聚合的程度，或與顯色劑生成有色物的配位數發生改變，會使光度法測定不符合比耳定律〔1〕。
1.3比色皿的厚度或光學效能不一致〔1〕。
如果裝試劑空白液的比色皿較其它比色皿薄或對光的吸收和反射少一些，則曲線的延線與縱座標相交；反之，與橫座標相交。因為各測點i:=a i-a0，當裝空白液的比色皿較薄時,a0值偏低,y i=a i-a0值偏高，反之,y i值偏低。
1.4顯色反應和反應條件的問題〔1〕。
當顯色反應的靈敏度不高時，被測物低於某一濃度就不能顯色，當濃度不同時，溶液對光的吸收、散射的程度不同，低濃度段往往彎曲，加上濃度高時部分膠體顆粒的聚沉，致使測定的吸光度降低，曲線上端向下彎曲。
1.5操作上的原因。
例如褪色反應，顯色溶液的顏色不穩定，易褪色，若比色時間超過了穩定時間，標準系
列中高濃度溶液顏色減褪，致使曲線上端向下彎曲。因此應控制好顯色劑的加入時間，可以每加3份，停3～3min，再加上3份，依次進行，以使每支比色管的顯色時間相近。
1.6干擾物質的影響。
2 提高標準曲線質量還需解決的幾個問題2.1 經空白校正後所得的零座標點是否應參加回歸計算
按書中要求，曲線應包括「經空白校正後就得零座標點」，因為標準曲線是由以原點開始的x0及隨後的x1x2……x n的座標點組成，如果在相關分析和回歸分析中包括了零座標點(x0)，則所得相關係數和回歸方程是代表x0～x n這條完整線段的。而筆者通過實踐認為：在繪製標準曲線時也應具體問題具體分析，如果低濃度段未見明顯彎曲(無「拐點」)時，零座標點應按特定的零濃度點參加回歸計算，其一，可加大樣本容量，增加曲線的相關性，其二，對於空白溶液和接近空白溶液濃度的樣品，應用回歸方程計算濃度時，顯得更加合理。
而如果有「拐點」時，零點不參加回歸計算效果更好。例如:2023年我們做了一條氰化物曲線就是這種情況。
見表1。如果零點參加回
歸，相關係數r=0.
9993,；如果零點不參加回歸,r=0.9998，而
截距a相差不多，可見，零點不參加回歸的相
關性更好，這種情況有時也會常碰到，需要指
出的是：在進行痕量分析時，例如用原子吸收84
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測水中重金屬含量時,零座標點必須參加回歸計算,因為從x0-x1這一段常是痕量分析結果所在的線段,包括空白溶液在內的低濃度段比高濃度更接近於「理想溶液」,不必顧慮低濃度段在進行光度法測定時不符合比耳定律。總之,如果曲線的線性好,r值大,下端無「拐點」,零點參加回歸對斜率的影響不大,截距的數值略有減小,相關係數略有增加;如果曲線下端有「拐點」,零點參加回歸後,效果反而不好。
表1氰化物曲線
ni1234567異菸酸xi0.200.50 1.
00 2.00 3.00 4.
00 5.00吡唑啉酮比yi0.0070.
0240.0700.1600.
2500.3400.421色法
2.2斜率b的範圍:
書中只對so2和nox的斜率b做了規定,而對水質監測並沒有做詳細說明,通過多次方法驗證確定出酚標準曲線斜率b的範圍為0.018～0.022,單位為吸光度/ug。
(4—氨基安替比林直接光度法)
2.3截距a為何不等於零?
當用扣除空白溶液吸光度的數值(y)進行回歸時,理論上a應為零,但實際上截距a 等於零的情況是很罕見的。試劑空白值a0,如果只是一次測定值,可靠性就差一些,如進行平行測定,取其平均值,可以減少誤差,即使是取平均值,它和標準系列中其它各試管的試劑空白值也不會完全一致,在進行空白校正即y i=a i-a0時,不能完全抵消,加上各測點的測定(包括試劑空白值)都存在誤差,尤其是高濃度段測點誤差影響較大,能改變曲線的走向,使其偏離座標原點,產生截距。另外,在回歸運算過程中,經資料取捨,也能引入誤差。
總之,截距是誤差造成的。系統誤差減至可接受的程度後,隨機誤差總是存在的,因此截距一般不為零,若存在顯著的系統誤差或操作失誤,測得的a值較大時,應找出原因後,重新繪製標準曲線。
2.4測定結果的估算:
當採用回歸方程序估算結果時,可以採用以下公式:y=bx+a,對於濃度低的樣品,當截距略大時,用此公式算出來的結果偏低,甚至是負值,在實際工作中並不能說明問題。例如:
2023年我們做了一條酚曲線:y=0.0166+0.
0204x,r=0.9999,用此曲線測定考核樣雖然合格,但在實際工作中測定我廠煤氣站洗滌水中酚含量時結果全是負值或未檢出,這個結果讓我們無法接受,而書中也並未對酚曲線中a值做出規定,同一吸光度採用另一條曲線卻可以監測出結果來,在實際工作當中我們常碰到此種情況,同一曲線雖然適用於考核樣,但卻不適宜實際工作中。這就說明在實際工作中,待測物濃度低的情況所佔的比例較大,直接用回歸方程序計算低濃度樣品的結果是不妥的。
即然截距是誤差造成的,就應對這個誤差的後果進行檢驗,看看回歸線的截距a與座標原點(0,0)之間是否有顯著性差異,如經檢驗並無顯著性差異,說明a和0之間的差異是隨機誤差造成的,此時截距a對零點來說並無實際意義,可以作零處理,公式y=bx+a可以簡化為y =bx,用此公式計算測定結果不會出現負值。
2.5回歸直線的精密度
為了進行a=0的假設檢驗,需計算出回歸線的剩餘標準差s f,在一元線性回歸分析中,可以用s f來描述回歸直線的精密度,進而對y值作近似的區間估計。s f是試驗的實測點圍繞回歸線離散程度的量度。計算公式如下:
s f=
1(n-2)
σni=1
(y i-y i)2
=(1-r2)s(yy)
n-294
=(1-r2)〔σy2-(σy)2/n
n-2式中:(y i-y
i)是實測值y i與最佳值y i 之差,s(rr)是因變數y i的差方程。線性好時,相關係數大,s f小,精密度好。
2.6回歸直線的統計檢驗:
此處僅提及a=0假設檢驗,先計算出統
計量t,t=
|a-a0|
s f1/n+(x2/s(xx)
然後確定顯著性水平α,查t分布表,從而得出結論,截距a與0之間有無顯著性差異。在實際工作中,存在著s f的代表性問題,對於指定的監測專案,當採用指定的方法時,計算統計量t的公式中,n、x、s(測點數、自變數平均值、自變數差方和)都是常數,統計量t值與a的絕對值成正比,與s f成反比例如表2是兩條標準曲線的統計量。
表2 兩條標準曲線的統計量
曲線一,精密度差曲線二,精密度好n88
s f0.003360.00151
a0.003470.00252
t 1.609 2.66
結論tα
1與o無顯著差異,
可以作零處理
t>t0.05(6)α2
與o的差異顯著,
不可以作零處理
t(0.05(6)=2.447 顯然,這樣的結論是不能接受的,它不合理。
眾所周知,在t檢驗中,當s f很大時,無顯著性差異的結論是不一定可靠的;同理,當s f很小時,有顯著性差異的結論也不一定可靠。根據經驗,一般說來,水質監測標準曲線的回歸方程中,截距|a|<0. 009為宜。
這樣,原標準曲線中所含的誤差不大,計算所得回歸方程將a作零處理後,即可用於計算未知樣的測定結果。
對於成熟的分光光度法,在實踐中,確實截距a的數值較小,但如果沒有對a給出控制限,當a較大時,也都採用簡化公式或回歸方程序計算,則會導致顯著誤差或得到負值結果,會使分析人員難於解釋。因此筆者建議對水質的常規監測方法,通過調查及檢驗,也應該確定統一的對截距的控制指標,這樣做無疑是有益的。
2.7 標準曲線上可疑值的檢驗。
標準曲線上可疑值的檢驗共有以下五種方法:(在此本文不詳細作一一說明)1.標準化殘差法〔2〕規定殘差di即(y i-y i)的控制限;3.
將殘差從吸光度換算為待測物的含量△x i,規定△x i的最大允許值作為控制限;4.規定相關係數應大於0.999;5.
殘差迴圈檢驗法。(此法有利於提高標準曲線的精確性。)
2.8 分割槽加權回歸方法
現行標準曲線回歸方法中存在著影響回歸直線精確度的問題,主要表現在各測點對於統計量的相對偏差分布不均勻(相對偏差| (y i-y i)/y i|×100%的標準差偏大),低濃度區遠大於高濃度區,回歸得到的標準曲線用於樣品(特別是低濃度樣品)的測定,會僅因使用此曲線而造成誤差。針對這一問題產生的原因,可以採用分割槽加權回歸方法確定標準曲線方程,加重了低濃度區對標準曲線的影響,有利於各測點(特別是易產生較大相對偏差的低濃度測點)對於統計量的相對偏差均勻分布,且使總體相對偏差σ〔(y i-y i j22/y i〕)減少,可提高測定的準確度;由於採用了分割槽加權和濃度與權相聯絡的方法,使權的分配更趨合理,避免了過分加大低濃度區測點的權數而導致高濃度區測點對於統計量的相對偏差過大的現象,較好地解決了上述問題。
2.9 多條標準曲線的精密度檢查
我站6人在做考核樣時共做6條標準曲線(每人一條)這就要求考查標準曲線的精密度,因為多次測定的平均值的標準誤差s x與標準差sx成正比,與測定次數n的平方根成反比。當測定次數n從1次增加到5次時, s x的數值下降顯著,以後n再增大時,s x下
05降緩慢,一般取n=6。《環境水質監測質量保證手冊》第280頁介紹,經s1=s2、b1=b2、a1=a2的假設檢驗後,若無顯著性差異,可將兩條標準曲線合併成一條共同的曲線。在多條曲線中對兩條差別最大的曲線進行s、b、a 的檢驗後,若無顯著性差異,可將多條標準曲線合併成一條相同曲線。
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