色譜分離方法[1]
根據分離原理還可將色譜法分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、凝膠色譜、親和色譜、電泳色譜、氣相色譜等。利用物質吸附能力不同進行分離的稱為吸附色譜，常用的吸附劑有矽膠、氧化鋁、聚醯胺、活性炭、大孔吸附樹脂等。利用物質在兩相不互溶的溶劑中的分配比不同進行分離的稱為分配色譜，常用的支援劑有矽膠、矽藻土、纖維粉等，液滴逆流色譜（dccc, droplet counter current chromatography）和高速逆流色譜(hsccc , high speed counter current chromatography)則是在分配色譜與逆流分溶相結合的基礎上發展而成的一種新技術。
利用物質解離程度不同進行分離的稱為離子交換色譜，常用的離子交換樹脂有強酸型（磺酸型）、強鹼型（季胺型）、弱酸型（羧酸型）、弱鹼型（**胺型）等。利用物質分子大小不同進行分離的稱為凝膠色譜（亦稱分子篩或排阻色譜），常用的支援劑有葡聚醣凝膠、羥丙基葡聚醣凝膠等。利用電流通過時，離子趨電性不同進行分離的稱為電泳色譜，常用的有紙電泳、瓊脂電泳、凝膠電泳等。
本書將根據其在天然藥物分離工作中的重要性擇要介紹。
色譜法的特點是分離效果好，對於經典方法難以得到分離的化合物採用色譜法往往可以得到滿意的分離，但對於所用的吸附劑或支援劑、試劑、儀器裝置等要求較高，技術操作較細緻，操作週期也較長，故在工業生產中用得較少，目前主要是作為一種實驗室常規分離方法用於天然藥物中生物活性成分及化學成分的研究。
由於天然藥物中有效成分的結構型別不同，理化性質也不同，所以選擇的色譜方法也是不同的，要根據具體情況選定。
通常生物鹼的分離可選用矽膠或氧化鋁色譜，對於極性較強的生物鹼可選用分配色譜或反相色譜，對於鹼性較強的生物鹼可選用離子交換色譜，對於水溶性生物鹼如季胺型生物鹼、氮氧化物生物鹼等也可選用分配色譜或離子交換色譜。
苷類化合物的色譜分離與苷元的性質有關，對於水溶性較大的苷如皂苷、強心苷等通常採用分配色譜或反相色譜分離，對於水溶性較小的苷則可採用吸附色譜分離。
揮發油、甾體、萜類、萜類內酯（成苷者除外）等往往首選矽膠及氧化鋁色譜，若在氧化鋁色譜上有次級反應，則宜用矽膠吸附色譜分離。
黃酮類、醌類等含有酚羥基的化合物則可採用聚醯胺色譜進行分離。
有機酸、氨基酸等含有羧基或氨基類的化合物通常可選用離子交換色譜進行分離，有時也可用分配色譜進行分離。氨基酸類化合物還可採用活性炭色譜進行分離。
對於大分子化合物如多肽、多聚糖、蛋白質以及極性較大的化合物則通常採用凝膠色譜進行分離。
第一節矽膠柱色譜
矽膠色譜是最常用的色譜方法，適用於親脂性成分的分離，廣泛用於萜類、甾體、強心苷、苯丙素、黃酮、醌類、生物鹼等類化合物的分離。它具有價廉、分離效果好、再生容易、適用範圍廣、不易與有機酸、酚類以及色素等類化合物形成不可逆吸附，樣品損失較少、**率較高、副反應較少等優點。但與氧化鋁色譜相比，具有分離效果較差、樣品處理量較少、對雜質的吸附能力較差等缺點。
二． 矽膠吸附色譜
（一）．色譜柱的選擇
有多種多樣的色譜柱可供選擇（見圖2-1）。下端帶有玻璃塞的或不帶有玻璃塞的以及帶有垂熔篩板的均可選用 。吸附色譜所用的洗脫劑均為有機溶劑，因有機溶劑可溶解在玻璃塞上起潤滑和密封作用的凡士林，故對玻璃塞的密封和潤滑需要用澱粉甘油糊，而不能用凡士林。
在用不帶有玻璃塞的色譜柱時，含氯的溶劑如氯仿、二氯甲烷等對膠管的腐蝕很大，常會導致膠管的膨脹和變形，在使用時要經常檢查下端連線的膠管，以防洗脫劑發生洩漏，造成柱中的洗脫劑流幹，導致分離的失敗。柱內徑與柱長之比通常為1:10－1:
20,若柱粗而短，則分離效果較差。若柱過長而細，分離效果雖好，但流速慢，消耗時間太長。樣品長時間吸附在矽膠上和長時間被光照射會使樣品中的某些成分發生變化，過長的柱子裝填均勻難度也較大，故通常對於分離複雜樣品常先使用短而粗的柱子進行粗分，然後對於已經過粗分且成分相對較簡單的樣品再用細而長的柱子進行分離。
所用的色譜柱應比裝入吸附劑的柱長再長一段，以備存有一定量的洗脫劑。為了防止溶劑的揮發及減少溶劑的加入次數，色譜柱上可覆一玻璃瓶或裝乙個分液漏斗，記憶體色譜用溶劑。
（二）．吸附劑的用量
吸附劑的用量要根據被分離樣品的組成及其是否容易被分開而決定。一般來說，吸附劑用量為樣品量的20－50倍。若樣品中所含成分的性質很相似，則吸附劑的用量要加大，可增至100倍或更大些。
矽膠對極性較小的化合物如萜烯、倍半萜烯等的吸附力較弱，其用量應加大，可為樣品量的100－200倍。
（三）．裝柱方法
色譜柱要求填裝均勻，且不帶有氣泡。若鬆緊不一致，則被分離物質的移動速度不規則，影響分離效果。裝柱時首先將色譜柱垂直的固定在支架上，在管的下端塞少許棉花，使棉花成為乙個表面平整的薄層，然後用下述方法裝柱。
1．幹裝法將矽膠均勻的倒入柱內，中間不應間斷。通常在柱的上端放乙個玻璃漏斗，使矽膠經漏斗成一細流狀慢慢地加入柱內。必要時輕輕的敲打色譜柱，使填裝均勻，尤其是在填裝較粗的色譜柱時，更應小心。
色譜柱裝好後開啟下端活塞，然後沿管壁輕輕倒入洗脫劑（注意在洗脫劑倒入時，嚴防矽膠被衝起），待矽膠濕潤後，在柱內不能帶有氣泡。如有氣泡需通過攪拌等方法設法除去，也可以在柱的上端再加入洗脫劑，然後通入壓縮空氣使空氣泡隨洗脫劑從下端流出。
2．溼裝法因濕法裝柱容易趕走矽膠內的氣泡，故一般以濕法裝柱較好。量取一定量體積的準備用作首次洗脫的洗脫劑（vo），倒入色譜柱中，並將活塞開啟，使洗脫劑滴入接受瓶內，同時將矽膠慢慢的加入；或將矽膠放置於燒杯中，加入一定量的洗脫劑，經充分攪拌，待矽膠內的氣泡被除去後再加入柱內（因後一種方法對矽膠內的氣泡除去的較完全，故最常用）。一邊沉降一邊新增，直到加完為止。
矽膠的加入速度不宜太快，以免帶入氣泡。必要時可在色譜柱的管外輕輕給與敲打，使矽膠均勻的下降，有助於矽膠帶入的氣泡外溢。矽膠加完後，仍使洗脫劑流滴一段時間，然後使色譜柱中高於矽膠面上的洗脫劑幾乎全部流入接受瓶內，正確計量接受器中的溶劑量（v1），vo-v1之差即為色譜柱內包含的洗脫劑的體積，即色譜柱的保留體積。
知道保留體積多少，就能主動掌握大致在什麼時侯收集洗脫液，當變換洗脫劑的時侯，也能估計到新洗脫劑的流份在什麼時侯開始。
為了使色譜柱裝的更加均勻，提高分離效果，同時也為了除去矽膠中含有的雜質，通常是色譜柱裝好後，先不急於上樣品，而是先用洗脫劑洗脫一天，待**洗脫劑後**瓶中沒有殘渣時在上樣品。
（四）．樣品的加入
樣品的加入有兩種方法，即濕法加樣和乾法加樣。濕法加樣雖然具有吸附劑對樣品的死吸附較少和樣品**率較高等優點，但因所用溶劑較難選擇、樣品譜帶較寬以及獲得均勻的樣品譜帶較難等缺點，故較少使用。
1．濕法加樣先將樣品溶解於用作首次使用的洗脫劑的溶劑中，如果樣品在首次使用的洗脫劑中不溶解，可改用極性較小的其它溶劑，但溶劑的極性要盡可能的小，否則會大大的降低分離效果，並有可能導致分離的失敗（需完全溶解，不得有顆粒或固體）。溶液的體積不能過大，體積太大往往會使色帶分散不集中，影響分離效果，通常樣品溶液的體積不要超過色譜柱保留體積的15％。先將色譜柱中矽膠面上的多餘洗脫劑放出，再用滴管將樣品溶液慢慢加入，在加入樣品時勿使柱面受到擾動，以免影響分離效果。
2．乾法加樣先將樣品溶解在易溶的有機溶劑中。樣品體積不要太大，通常不要超過色譜柱保留體積的30％，否則會造成死吸附過多和大量樣品進入多孔性矽膠的內部，影響分離效果和降低樣品的**率，同時樣品與矽膠一同加熱時間過長，也會導致樣品中的某些成分發生變化。但樣品體積也不宜太小，樣品體積太小會造成溶液過濃，同樣也會影響分離效果。
稱取一定量矽膠（通常為色譜柱中矽膠量的10％－15％），置於蒸發皿中，用滴管慢慢加入樣品溶液，邊加邊攪拌，待矽膠已完全被樣品溶液濕潤時，在水浴鍋上蒸除溶劑，如果樣品溶液還沒有加完，則可重複上述步驟，直到加完為止。蒸除溶劑後的附有樣品的矽膠在100 °c加熱3小時除去水分後，按濕法裝柱的方法裝入柱內，但要注意在樣品加入時不要使柱面受到擾動。
(五)．展開與洗脫
樣品溶液全部加完後，開啟活塞將液體徐徐放出，當液面與柱面相平時，再用少量溶劑洗滌盛樣品的容器數次，洗液全部加入色譜柱內，開始收集流出的洗脫液，當液面與柱面相同時，緩緩加入洗脫溶劑，使洗脫劑的液面高出柱面約10厘公尺。在柱面上加入乙個直徑與色譜柱內徑相同的並扎有許多小孔的濾紙片，然後再加入約兩厘公尺厚的矽膠（慢慢加入，並緩緩攪拌，盡量除去矽膠中的氣泡），最後在矽膠上方加入一團脫脂棉花，以防止每次加入洗脫溶劑時破壞色譜柱面，影響分離效果。有色物質在日光下即可觀察到明顯的色譜帶，有些無色物質雖然在日光下觀察不到色譜帶，但在紫外光的照射下可以觀察到明顯的螢光色譜帶。
流份的收集既可按色譜帶收集，也可按等餾份收集法收集。由於乙個色帶中往往含有多個成分，故現在常常採用等餾分收集法收集，即分取一定洗脫液為乙份，連續收集。理論上每份收集的體積越小，則將已分離開的成分又重新人為地合併到一起的機會就越少，但每份收集的體積太小，必然要大大的加大工作量。
每份洗脫液的收集體積，應根據所用矽膠的量和樣品的分離難易程度的具體情況而定，通常每份洗脫液的量約與柱的保留體積或矽膠的用量大體相當。如所用矽膠的量為200g，則每份洗脫液收集的量約為200ml。但若所用洗脫劑的極性較大或被分離成分的結構很相近，則每份的收集量要小一些。
為了及時了解洗脫液中各洗脫部分的情況，以便調節收集體積的多少和選擇或改變洗脫劑的極性，現在多採用薄層色譜或紙層色譜的方法來檢查。根據色譜的結果，可將成分相同的洗脫液合併或更換洗脫劑。採用薄層色譜或紙層色譜的方法來檢查洗脫液的分離情況，既可在**溶劑之前，也可在**溶劑之後，應根據具體情況而定。
通常當上樣量較大時，**溶劑後進行，當上樣量較少時，則在**溶劑之前進行。**溶劑後，用易溶的溶劑溶解，在放置過程中有時可得到單一成分。如果仍是幾種成分的混合物，則還需進行進一步的分離。
在整個操作過程中，必須注意不使吸附劑表面的液體流乾，否則會使色譜柱中進入氣泡或形成裂縫。同時洗脫液流出的速度也不應太快，流速過快，柱中交換達不到平衡，均能影響分離效果。
(六)．洗脫劑（展開劑）的選擇
矽膠、氧化鋁等對天然藥物中生物活性成分及化學成分的吸附屬於物理吸附（physical adsorption）,亦稱表面吸附，是由於吸附劑表面分子與溶質及溶劑分子的分子間力相互作用而引起的。物理吸附的特點是無選擇性、吸附與解吸附過程可逆、且可快速進行，吸附強弱及先後順序大體遵循「相似者易於吸附」的經驗規律。在分離過程中溶質分子與溶劑分子、溶質分子相互間對吸附劑表面發生不斷爭奪。
由於化學結構不同，其性質就不同，對吸附劑表面的爭奪能力也就不會相同，故可以通過色譜方法將不同化學結構的成分分開。同樣溶劑不同，其對吸附劑表面的爭奪能力就不同，故溶劑不同，其洗脫能力也就不同。
矽膠、氧化鋁等均為極性吸附劑，故有以下特點：化合物的極性越強，吸附劑對其吸附力就越強，流出柱的速度就愈慢或rf值就越小；洗脫劑的極性越大，其洗脫能力就愈強；吸附劑的含水量愈大，其對化合物的吸附力就愈弱。值得注意的是洗脫劑的洗脫能力與其極性雖有關係，但並不呈線性關係，如極性大體相同的氯仿－丙酮混合液和氯仿－甲醇混合液，其對化合物的洗脫能力可能會相差很大，有時用前者可以將幾個化合物分開，用後者就不一定能分開，但也有可能相反。
在分離過程中不僅要考慮化合物與吸附劑表面的相互作用，而且還要考慮化合物與洗脫劑間的相互作用，如形成分子間氫鍵、洗脫劑對化合物的溶解度等。
再選用洗脫劑時，應從低極性溶劑開始，然後逐步增加洗脫劑的極性，使吸附在吸附劑上的成分逐個被洗脫下來，從而達到分離的目的。如果樣品極性小，可選用石油醚或（環）己烷作為起始溶劑，如果樣品極性較大則可選用氯仿或苯或乙酸乙酯等作為起始溶劑，待起始溶劑中不再有成分被洗脫下來時，再加大洗脫劑的極性，而且極性要逐漸加大。
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