層析柱分離的一般是本身有顏色或在紫外燈下有螢光的物質。必須先做薄層色譜（tlc）分離試驗，以尋找柱色譜的最佳分離條件。
1.薄層色譜操作方法：
所需的東西主要有溶劑、展開劑、玻璃點樣毛細管（內徑0.3mm）、矽膠鋁箔板、染缸。
將被分離的試樣用溶劑溶解後，用玻璃點樣毛細管（內徑0.3mm）蘸取少量溶液，在距薄層板底端約10mm處點樣，斑點直徑不要過大，約2mm即可，待樣點乾後放入盛有少量展開劑的染缸中展開。試樣中各組分在薄層板上上公升的高度依賴於組分在展開劑中的溶解能力和被吸附劑吸附的程度，選取合適的展開劑就可將代表各組分的樣點分離開。
注意：樣點要在染缸中展開劑的液面以上。
化合物在薄層板上上公升的高度與展開劑上公升的高度的比值稱為該化合物的比移值 rf（0≤rf≤1）。（計算上公升高度的起始位置是樣點的原始位置）同等條件，極性小的組分rf大（即上公升的距離大），極性大的組分rf值小（即上公升的距離小）。rf等於物質移動的距離除以溶劑移動的距離。
兩物質的△rf應大於0.2，過柱才能有效分離兩物質。
單一溶劑極性和展開能力遞增順序：
石油醚《正己烷《環己烷《四氯化碳《苯《甲苯《氯仿《二氯甲烷《乙醚《乙酸乙酯《吡啶《異丙醇《丙酮《乙醇《甲醇《水《乙腈。
多元展開劑應互溶，且被分離物也最好能溶解於其中。由實驗確定所需用的展開劑的方法為：選用乙個極性強的溶劑和乙個極性弱的溶劑並按不同比例調配，即在非極性溶劑中加入少量極性溶劑，極性由弱到強，比例由小到大，以得到合適的比例。
一般最常用的是乙酸乙酯（極性較高）和石油醚（非極性）。先用乙酸乙酯作為展開劑點板，若樣點隨展開劑整體移動位移較大，用如上的方法，在石油醚中逐漸加大乙酸乙酯的比例，可找到合適的比例將樣點分開；若樣點能明顯的分開，用乙酸乙酯即可；如若樣點在原地不動或動的很少，則需加大展開劑的極性，選用乙醇作展開劑，再和石油醚配比，以求能分開，如用乙醇樣點仍原地不動或動的很少，則需再加大展開劑的極性，直至樣點能分開。（若待分離的試樣極性特別高可選用乙腈+水+少量磷酸二氫鉀）。
理論上可以通過調節石油醚和乙酸乙酯的比例，獲得可以取代極性在石油醚和乙酸乙酯之間的各種溶劑，但考慮到試樣的溶解性，有時也需要用到甲苯、氯仿、二氯甲烷等溶劑。
2.柱色譜操作方法：
所需的東西主要有溶劑、洗脫劑（即薄層色譜用的展開劑）、柱層析矽膠（200-300目）、層析柱、若干三角瓶。
柱層析分離時，極性小的組分先被淋洗出來，極性大的後出來。
我們用的薄層板是矽膠鋁箔板，所以要選的吸附劑是柱層析矽膠，一般選用200-300目的，目數越大分離效果越好，但是分離速度越小；洗脫劑即為薄層色譜選好的展開劑。
裝柱：用濕法裝柱，吸附劑必須均勻的填在柱內，沒有氣泡和裂縫。將層析柱在鐵架台上調節高度豎直固定好，接洗脫液的三角瓶要能方便的換取。
關閉柱下端的活塞，加入純洗脫劑到柱的四分之一高度，在燒杯中將洗脫劑和吸附劑配製成糊狀，粘度要偏小一些，不要太稠。開啟活塞，將糊狀物倒入柱中，倒一部分就用橡膠管拍打柱身，讓吸附劑填料均勻，再倒再拍打。柱裝好後，關閉活塞，上塞橡膠塞，讓其自然沉降，沉降後吸附劑的高度為柱高度的1/2-2/3，再加0.
3mm厚的石英砂層。自然沉降過程一般需幾小時。
剛開始灌柱時，柱子的開關應關上，用雙聯球略加壓，壓實下方的矽膠吸附劑，這樣柱下方的石英砂塊周邊不易漏下矽膠。
加試樣的溶液：用盡量少的溶劑將試樣溶解好（分離試樣的量與層析柱的直徑和長度有關，還與試樣的溶解性有關。）。
在柱下方用三角瓶接洗脫劑，旋開活塞，待洗脫劑液面與石英砂層上表面相平時，用滴管緩慢的將溶液順著柱壁加入柱中，千萬不能加得過快，以免將矽膠濺起或衝起。溶液加完後，等溶液液面與石英砂層上表面相平時，加2-3滴管的溶劑將柱壁上的試樣洗下去，再等溶液液面與石英砂層上表面相平後，再加2-3滴管溶劑，反覆幾次，直至石英砂層上面的溶液變為無色或淺色。再小心的加入大量的洗脫劑，並不時的補加，不能讓洗脫劑的水平面低於石英砂層的上端。
展開和分離：隨時關注層析柱中各組分帶的位置變化。如分離的是有顏色的試樣，注意各色帶的位置，經點板檢驗分別收集在三角瓶中即可。
如是有螢光性的物質，則需經常點板後照紫外燈，以隨時掌握各組分的洗脫情況，再根據點板的結果分別收集各組分。收集完所需要的組分後，用雙聯球加壓，讓殘留在柱中的溶劑和洗脫劑完全流出後，再將柱子裡的矽膠弄出來用塑膠袋裝著扔掉。層析柱先用自來水沖洗，再用試樣的溶劑清洗，並用雙聯球加壓，將石英砂板上可能殘留的試樣洗乾淨，最後用蒸餾水潤洗後乾燥即可。
有時一種洗脫劑不能將試樣分離完全，就需要在分離的過程中換洗脫劑。一般洗脫劑應是試樣的溶劑，但有時逼不得已，洗脫劑不是試樣的良溶劑時，也可以分離，不過要在加溶液之前和之後加少量溶劑，作乙個緩衝帶以利於各組分的展開和分離。
最後將收集的各組分旋轉蒸發乾燥後就可得分離的產物了。
柱長和柱直徑一般為：10/1到20/1。
● 待分離物質的溶液高度為柱中矽膠吸附劑的體積的1/10到1/30。
● 兩物質的rf應大於0.2，過柱才能有效分離兩物質。
● 過柱時，樣品濃度也不宜過大，濃度過大粘度大，分離效果差，一般不超過4%
高效液相色譜柱柱效測定及分離條件考察
一 實驗目的 1 了解高效液相色譜儀的基本結構和工作原理 2 學習高效液相色譜儀的使用 3 學習 掌握液相色譜柱柱效測定方法 4 考察流動相配比對分離情況的影響 二 基本原理 高效液相色譜法是以液體作為流動相的一種色譜分析法，它亦是根據不同組分在流動相和固定相之間的分配係數的差異來對混合物進行分離的...
色譜分離技術
色譜分離方法 1 根據分離原理還可將色譜法分為吸附色譜 分配色譜 離子交換色譜 凝膠色譜 親和色譜 電泳色譜 氣相色譜等。利用物質吸附能力不同進行分離的稱為吸附色譜，常用的吸附劑有矽膠 氧化鋁 聚醯胺 活性炭 大孔吸附樹脂等。利用物質在兩相不互溶的溶劑中的分配比不同進行分離的稱為分配色譜，常用的支援...
色譜柱相關知識總結
第二章氣相色譜柱 第一節氣相色譜柱的型別 氣相色譜法 gas chromatography,簡稱gc 亦稱氣體色譜法，氣相層析法。其核心即為色譜柱。氣相色譜柱有多種型別。從不同的角度出發，可按色譜柱的材料 形狀 柱內徑的大小和長度 固定液的化學效能等進行分類。色譜柱使用的材料通常有玻璃 石英玻璃 不...