因為g+c=40%所以
a+t=1-40%=60%tm值與g+c的含量與有關其經驗公式為tm=[x(g+c)/2.44]+69.3
(其中x（g+c）為g與c所佔的鹼基比例)故tm=69.464(攝氏度)
pcr的第一步就是引物設計了。引物設計需要注意的地方很多，在大多數情況下，我們都是在知道已知模板序列時進行pcr擴增的。在某些情況比如構建文庫的時候也會在不知道模板序列的情況下進行設計。
這個時候隨機核苷酸序列就與模板不是完全匹配。我們通常指的設計引物都是在已知模板序列的情況下進行。
設計的目的是在兩個目標間取得平衡：擴增特異性和擴增效率。引物分析軟體將試圖通過使用每一引物設計變化的預定值在這兩個目標間取得平衡。設計引用有一些需要注意的基本原理：
①引物長度
一般引物長度為18~30鹼基。總的說來，決定引物退火溫度（tm值）最重要的因素就是引物的長度。有以下公式可以用於粗略計算引物的退火溫度。
在引物長度小於20bp時：[4(g+c)+2(a+t)]-5℃
在引物長度大於20bp時：62.3℃+0.41℃(%g-c)-500/length-5℃
另外有許多軟體也可以對退火溫度進行計算，其計算原理會各有不同，因此有時計算出的數值可能會有少量差距。為了優化pcr反應，使用確保退火溫度不低於54℃的最短的引物可獲得最好的效率和特異性。
總的說來，每增加乙個核苷酸引物特異性提高4倍，這樣，大多數應用的最短引物長度為18個核苷酸。引物長度的上限並不很重要，主要與反應效率有關。由於熵的原因，引物越長，它退火結合到靶dna上形成供dna聚合酶結合的穩定雙鏈模板的速率越小。
②gc含量
一般引物序列中g+c含量一般為40%~60%，一對引物的gc含量和tm值應該協調。若是引物存在嚴重的gc傾向或at傾向則可以在引物5』端加適量的a、t或g、c尾巴。
③退火溫度
退火溫度需要比解鏈溫度低5℃，如果引物鹼基數較少，可以適當提高退火溫度，這樣可以使pcr的特異性增加；如果鹼基數較多，那麼可以適當減低退火溫度，是dna雙鏈接合。一對引物的退火溫度相差4℃～6℃不會影響pcr的產率，但是理想情況下一對引物的退火溫度是一樣的，可以在55℃～75℃間變化。
④避免擴增模板的二級結構區域
選擇擴增片段時最好避開模板的二級結構區域。用有關計算機軟體可以**估計目的片段的穩定二級結構，有助於選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能（△g）小於58.
6lkj/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用7-deaza-2』-脫氧gtp取代dgtp對擴增的成功是有幫助的。
⑤與靶dna的錯配
當被擴增的靶dna序列較大的時候，乙個引物就有可能與靶dna的多
個地方結合，造成結果中有多個條帶出現。這個時候有必要先使用blast軟體進行檢測，**：選擇align twosequences (bl2seq)，如下圖。
blast的使用方法也十分簡單，如下圖所示。
將引物序列貼上到1區，將靶dna序列貼上到2區，這兩者可以互換的，並且blast會計算互補、反義鏈等多種可能，所以不需要使用者注意兩條鏈是否都是有義鏈。如果知道序列在資料庫中的gi號也可以直接輸入gi號，這樣就不用貼上一大段的序列了。最後在3處點選align就可以檢視引物在靶dna中是否有多個同源位點了。
可是使用blast還是有其不方便的地方。因為它一次只能比較兩條序列，那麼一對引物就需要分開進行比對。如果存在錯配，還需要自己計算由於錯配形成的片段長度有多大。
在下一篇中將介紹乙個軟體，可以直接將靶dna和引物輸入對產物片段進行**。
⑥引物末端
引物3』端是延伸開始的地方，因此要防止錯配就從這裡開始。3』端不應超過3個連續的g或c，因這樣會使引物在g+c富集序列區錯誤引發。3′端也不能有形成任何二級結構可能，除在特殊的pcr（as-pcr）反應中，引物3′端不能發生錯配。
如擴增編碼區域，引物3′端不要終止於密碼子的第
3位，因密碼子的第3位易發生簡併，會影響擴增特異性與效率。
⑦引物的二級結構
引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會摺疊成髮夾狀結構，這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。若用人工判斷，引物自身連續互補鹼基不能大於3bp。兩引物之間不應該存在互補性，尤應避免3′端的互補重疊以防引物二聚體的形成。
一般情況下，一對引物間不應多於4個連續鹼基的同源性或互補性。
⑧為了下一步操作而產生的不完全匹配
5』端對擴增特異性影響不大，因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、螢光、地高辛、eu3+等；引入蛋白質結合dna序列；引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。
額外的鹼基或多或少會影響擴增的效率，還加大引物二聚體形成的機率，但是為了下一步的操作就要作出適當的「犧牲」。
很多時候pcr只是初步轉殖，之後我們還需要將目的片段亞轉殖到各種載體上，那麼就需要在pcr這個步驟為下一步的操作設計額外的鹼基。以下總結一些為了亞轉殖所要設計的序列。
a新增限制性內切酶酶切位點
新增酶切位點是將pcr產物進行亞轉殖使用得最多的手段。一般酶切位點是六個鹼基，另外在酶切位點的5』端還需要加2～3個保護鹼基。但是不同的酶需要的保護鹼基數目是不相同的，例如：
salⅰ不需要保護鹼基，ecorⅴ需要1個，notⅰ需要2個，hindⅲ3個。其中，在原核表達設計引物時還有一些小技巧，大家可以參考：《原核表達之實驗前的分析》。
裡面一些規
則是所有表達都通用的。
有一種做法是在進行pcr反應的同時進行酶切，這樣就需要注意一些內切酶在pcr反應中的酶切反應率，見附錄。不過這種方法雖然方便但並不推薦。有時候，就是把pcr產物**後酶切再與載體連線效果都不盡理想，同步進行會使出現問題的原因變得更加複雜。
一旦出現問題，分析起來更麻煩。
b lic新增尾巴
lic的全稱是ligation-independent cloning，它是n**ogen公司專門為其部分的pet載體而發明的一種轉殖方法。用lic法製備的pet載體有不互補的12–15鹼基單鏈粘端，與目的插入片段上相應粘端互補。擴增目的插入片段的引物5'序列要與lic載體互補。
t4 dna聚合酶的3'→5'外切活性經短時間即可在插入片段上形成單鏈粘端。由於只能由製備好的插入片段和載體互相退火形成產物，這種方法非常快速高效，而且為定向轉殖。
c定向ta轉殖新增尾巴
在t載體剛出的時候大家都拍手稱讚，真是方便，哪個小子腦子這麼聰明想出來的。但是後來人們發現ta轉殖無法將片段定向轉殖到載體中，所以後來invitrogen推出了可以定向轉殖的載體，它的一端含有四個突出的鹼基gtgg。因此在pcr引物設計時也要相應的加上與之互補的序列，這樣片段就可以「有方向」了。
d in-fusion轉殖方法
這項技術是clontech還屬於bd的時候推出的，2023年在生物通可著實風光了一把，不但當選年度創新試劑還被大家投票為最受大家歡迎的試劑。此技術就其步驟來說是及其方便的，不需連線酶，不需長時間的反應。只要在設計引物的時候引入一段線性化載體兩端的序列，然後將pcr產物和線性
化的載體加入到含有bsa的in-fusion酶溶液中，在室溫下放置半個小時就可以進行轉化了。這種方法特別適合大批量的轉化。
如果要加入額外的鹼基總是或多或少會影響到整個pcr反應，比如在加入notⅰ的酶切位點後整個引物的退火溫度就會直線上公升（它識別的是8個鹼基，且全為gc），這樣使另外乙個引物的設計變得十分困難，因為一對引物間退火溫度相差不宜太遠。因此上面提到許多設計原則在實際應用中往往難以做到都符合。在碰到這些情況的時候，我們只能秉著「實踐是檢驗真理的唯一標準」這一原則，要試一試才能知道能否行得通了。
（生物通謝菲）
PCR引物的設計原則
引物應用核酸系列保守區內設計並具有特異性。產物不能形成二級結構。引物長度一般在15 30鹼基之間。g c含量在40 60 之間。鹼基要隨機分布。引物自身不能有連續4個鹼基的互補。引物之間不能有連續4個鹼基的互補。引物5 端可以修飾。引物3 端不可修飾。引物3 端要避開密碼子的第3位。1.引物的特異性...
如何更好的設計出PCR引物
pcr引物設計 pcr引物設計的目的是為了找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板dna序列。因此，引物的優劣直接關係到pcr的特異性與成功與否。要設計引物首先要找到dna序列的保守區。同時應 將要擴增的片段單鏈是否形成二級結構。如這個區域單鏈能形成二級結構，就要避開它。如這一段不能形成二級結...
實驗二PCR引物設計及評價 3課時
實驗二利用bioedit軟體進行pcr引物設計及評價 一 實驗目的 1 掌握引物設計的基本要求，並熟悉使用bioedit軟體進行引物搜尋。2 掌握使用軟體bioedit對設計的引物進行評價分析。二 實驗原理 一 引物設計原則 聚合梅鏈式反應 polymerase chain reaction 即pc...