實驗二利用bioedit軟體進行pcr引物設計及評價
一、實驗目的
1、掌握引物設計的基本要求，並熟悉使用bioedit軟體進行引物搜尋。
2、掌握使用軟體bioedit對設計的引物進行評價分析。
二、實驗原理
一、引物設計原則
聚合梅鏈式反應（polymerase chain reaction）即pcr技術，是一種在體外快速擴增特定基因或dna 序列的方法，故又稱基因的體外擴增法。pcr技術已成為分子生物學研究中使用最多，最廣泛的手段之一，而引物設計是pcr技術中至關重要的一環，使用不合適的pcr引物容易導致實驗失敗：表現為擴增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等。
現在pcr引物設計大都通過計算機軟體進行，可以直接提交模板序列到特定網頁，得到設計好的引物，也可以在本地計算機上執行引物設計專業軟體。引物設計原則如下：
1、引物應在序列的保守區域設計並具有特異性。引物序列應位於基因組dna的高度保守區，且與非擴增區無同源序列。這樣可以減少引物與基因組的非特異結合，提高反應的特異性；
2、引物的長度一般為15-30 bp。常用的是18-27 bp，但不應大於38，因為過長會導致其延伸溫度大於74℃，不適於taq dna聚合酶進行反應；
3、引物不應形成二級結構。引物二聚體及髮夾結構的能值過高(超過4.5kcal/mol)易導致產生引物二聚體帶，並且降低引物有效濃度而使pcr反應不能正常進行；
4、引物序列的gc含量一般為40-60%。過高或過低都不利於引發反應。上下游引物的gc含量不能相差太大；
5、引物所對應模板位置序列的tm值在72℃左右可使復性條件最佳。tm值的計算有多種方法，如按公式tm=4(g+c)+2(a+t)；
6、引物5'端序列對pcr影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物。可根據下一步實驗中要插入pcr產物的載體的相應序列而確定。
7、引物3』端不可修飾。引物3'端的末位鹼基對taq酶的dna合成效率有較大的影響。不同的末位鹼基在錯配位置導致不同的擴增效率，末位鹼基為a的錯配效率明顯高於其他3個鹼基，因此應當避免在引物的3'端使用鹼基a。
8、引物序列自身或者引物之間不能在出現3個以上的連續鹼基，如ggg或ccc，也會使錯誤引發機率增加；
9、g值是指dna雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部鹼基對的相對穩定性。應當選用3'端 g值較低（絕對值不超過9），而5』端和中間 g值相對較高的引物。引物的3』端的 g值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構並引發dna聚合反應；
值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如gc含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；在用作轉殖目的的pcr因為產物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低，在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。
bioedit是乙個效能優良的免費的生物序列編輯器，可在windows 95/98/xp/2000中執行，它的基本功能是提供蛋白質、核酸序列的編輯、排列、處理和分析。與dnaman相比，其分析內容相對豐富一些，而且提供了很多網路程式的分析介面和介面，與dnaman等軟體配合使用更好。尤其值得一提是利用bioedit能夠十分方面地根據指定的核酸序列繪製相應的質粒圖譜。
功能 序列輸入：多種序列輸入方式；
序列分類：按標題、位置 、定義、引數、注釋等分類；
成對排列：兩序列的最佳排列及計算同一性和類似性；
序列遮蔽：僅採用聯配中部分區域進行分析而排除其他。
核酸分析：組成、互補、反轉、翻譯、質粒、限制性內切酶；
蛋白質分析：氨基酸成分、疏水性輪廓 、疏水力矩平均數
翻譯或反翻譯：把dna或rna翻譯成蛋白質；
切換翻譯：在核酸和編碼蛋白質序列中切換核苷酸序列；
點圖[成對比較]：相互比較兩序列的矩陣，生成乙個點圖。
三、實驗內容
1、使用bioedit軟體進行hgh的mrna引物的設計。
2、使用bioedit對引物進行評價分析。
2、總結引物設計應注意的關鍵事項。
專題27實驗設計及評價
雙基知識 一 實驗設計步驟及分類 1 實驗設計及步驟 1 設計實驗基本方案 2 選擇最簡實驗方案 3 對實驗方案進行評價 2 實驗分類 按原理分類 1 製取實驗 2 性質實驗 3 測量實驗 二 化學實驗方案的內容 1 實驗名稱 2 實驗目的 3 實驗原理 4 實驗用品 5 實驗步驟 6 實驗現象記錄...
專題十實驗設計及評價
雙基知識 一 實驗設計步驟及分類 1 實驗設計及步驟 1 設計實驗基本方案 2 選擇最簡實驗方案 3 對實驗方案進行評價 2 實驗分類 按原理分類 1 製取實驗 2 性質實驗 3 測量實驗 二 化學實驗方案的內容 1 實驗名稱 2 實驗目的 3 實驗原理 4 實驗用品 5 實驗步驟 6 實驗現象記錄...
實驗設計及實驗方案的評價試題
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