作為目前最好、最專業的引物設計軟體，oligo的功能很強，在這裡我們介紹它的一些主要功能，如：普通引物對的搜尋、測序引物的設計、雜交探針的設計以及評估引物對質量等等。
在正式進行引物設計前，我們首先面臨的乙個任務就是向oligo程式匯入模板序列，根據不同的實驗情況，匯入模板有三種方法：
1、直接用鍵盤輸入：
a、點選file選單中的newsequence浮動命令，或直接點選工具欄中的newsequence命令，進入序列展示視窗；
b、此時即可鍵入dna序列；
c、如果需要的話，oligo提供鹼基回放功能，在邊鍵入時邊讀出鹼基，防止輸入錯誤。點選edit選單中的「readbackon」即可。
2、利用複製和貼上：當我們序列已經作為txt檔案存在或其它oligo不能直接open的檔案格式，如word檔案。html格式，這個功能就顯得很有用了。
在相應檔案中複製序列後在序列展示視窗貼上，oligo會自動去除非鹼基字元。當序列輸入或貼上完成後，點選accept/discard選單中的accept浮動命令，即可進入引物設計模式。
3、如果序列已經儲存為seq格式或者fasta,genbank格式時，oligo就可以直接開啟序列檔案。
點選file選單中的「open」浮動命令，找到所需檔案，開啟即可。
進入引物設計模式後，oligo一般會彈出三個視窗，分別是6-鹼基頻率視窗，鹼基退火溫度視窗以及序列內部鹼基穩定性視窗，其中的退火溫度視窗是我們引物設計的主視窗，其它的兩個視窗則在設計過程中起輔助作用，比如6-鹼基頻率視窗可以使我們很直觀地看到所設計引物在相應物種基因組中的出現頻率，
如果我們的模板是基因組dna或混合dna時，該資訊就顯得有用了，而內部穩定性視窗則可以顯示引物的5端穩定性是否稍高於3端等。
一、普通引物對的搜尋：
以mouse4e（cdna序列）為例。我們的目的是以mouse4e（2361bp）為模板，設計一對引物來擴增出600-800bp長的pcr產物。
1、點選「search」選單中的「forprimersandprobes」命令，進入引物搜尋對話方塊；
2、由於我們要設計的是一對pcr引物，因此正、負鏈的核取方塊都要選上，同時選上compatiblepairs.
在oligo預設的狀態下，對此引物對的要求有：a、無二聚體；b、3端高度特異，gc含量有限定，d、去除錯誤引發引物等。
3、剩下的工作是確定上、下游引物的位置及pcr產物的長度以及引物設計引數。
①單擊：「searchranges」按鈕，彈出「searchranges」對話方塊。輸入上游引物的範圍：
1-2000,下游引物的位置：100-2300;pcr產物的長度600-800bp.
②單擊「paramaters」按鈕進入「searchparameters」對話方塊，對話方塊種分三個活頁，分別是：不同設定，引數以及更多引數。
③在「普通設定」視窗，為我們提供了對引物非常直觀的設定方法，從高到低分六個等級，最後還有乙個使用者定製選項。
④當我們對引物的各種引數的含義及應該設定多大值並不是特別清楚時，就可以直接設定veryhigh/high等來完成對引物設計引數的設定。
⑤當我們選中「automaticallychangestring」後，oligo會在引物搜尋過程中：如果在高等級設定中無法找到引物對時自動降低乙個定級來進行搜尋，知道找到引物對。在設計反向pcr引物對時，就選中「inversepcr」核取方塊。
⑥我們還可以讓引物的長度可以改變，以適應設定的tm值或pe?（primeeffitions,引發效率）。也可以限定所選引物對的最大數目。
⑦在「parameters」視窗中，實際上需要我們改動的只有引物的長度，根據試驗的要求作相應的改變，如23nt.其他引數就使用oligo的預設值，一般無需改變。在「moreparameters」視窗中，一般也無需作任何改變，直接用oligo的預設值。
4、點選「確認」-「ok」進入搜尋視窗，再次單擊「ok」後，oligo自動完成引物對的搜尋，並出現乙個搜尋結果視窗。顯示出得到的引物對數目。
5、點選「ok」，出現「primerpairs」視窗，在視窗中列出了7對引物的簡單資訊，引物位置，產物長度，最佳退火溫度及gc含量。單擊「sort」按鈕，可以按產物長度，最佳退火溫度及gc含量從小到大或從大到小的順序排列。
6、點選任意一對引物，在旁邊馬上彈出乙個叫「pcr」的視窗，在視窗中我們可以看到這對引物在模板中的大概位置，最佳退火溫度（該溫度可以直接應用於我們實際pcr中的第二步退火）。另外還有引物的tm值，gc含量，引發效率，同時還計算出了產物的tm值於引物tm值的差異以及引物間tm值的差異。一般我們盡量保持前者在20度以內，後者在5-6度以內。
點選不同的引物對時，pcr視窗內容同時作相應的改變。
7、要想了解引物的詳細資訊，如二聚體，發卡結構形成情況、組成、tm值和錯誤引發位點等，這時只需點選「analyze」選單中的相應命令，就可以分別得到相關資訊。例如點選「duplexformation」,我們就可以得到上游引物間，下游引物間及上下游引物間形成二聚體的情況。同理，「hairpinformation」,「comp
ositionandtm」,「falseprimingsites」等命令就可以顯示出相關資訊。所有這些分析的結果都有助於我們從oligo搜尋得到的多對引物中選擇最佳的引物對。
需要說明的是，①如果一次搜尋得到的引物對太多時，我們可以適當提高選定的條件和規定更合適的搜尋範圍來減少引物對數；②引物一般盡量不要在3端或是離3端太近的位置形成二聚體，同時二聚體的自有能絕對值盡量小於10;3,對於錯誤引發，在普通pcr中，如果引發效率在160points以上時，就可能出現雜帶，在測序反應中，錯誤引發效率則應該嚴格控制在120points以下。
8、oligo中每對引物的詳細資訊可以直接匯出為乙個文字檔案：
首先點選「file」選單中的「print/s**eoptions」，在出現的對話方塊中的普通設定選中「selected」；在「analyzei」中選擇需要儲存的資訊，在「analyzeii」中選中pcr.
單擊確定按鈕退出，這時再次點選「file」選單，s**e浮動命令中的「datas**eas」,選擇路徑及檔名即可。
二、測序引物的設計
在oligo中，測試引物設計過程與普通引物設計大部分都很相似。
還是以mouse4e為例，假如我們要在600-800bp的位置設計一條測序引物。
open-search
在「search」視窗中，選中「sequencerrimer」,同時去除負鏈search的選中
在「searchrange」視窗，輸入正鏈的600-800bp
在「parameters」中選定veryhigh，引物長度改為18bp
結果行到11條測序引物，與普通引物同理，根據其詳細資訊就可以挑選到一條最佳的測序引物。結果得到11條測序引物，與普通引物同理，根據其詳細資訊就可以挑選到一條最佳的測序引物。
三、探針的設計：
探針的設計與測序引物設計基本相同，只需使「search」視窗的探針設計選中，改變探針的長度就可以。
四、評估引物對：
我們在各種文獻中查到的引物，如果直接進行pcr,往往很難重複別人的實驗結果。這時就想到，是不是引物的質量有問題？能不能用軟體來對這些問題引物進行一些分析呢？答案是肯定的。
1、點選file選單中的new命令；
2、在「editnewsequence」的視窗中用鍵盤輸入上游引物；
3、如果該引物的首位置不是1的話，可以在「edit」視窗中輸入新的5端位置數字，如20;
4、點選accept/discard選單的accept命令；
5、如果引物序列長度不同於當前的引物的話，可以從「change」選單中改變當前的引物長度；
6、選取當前序列為上游引物（點選「upper」按鈕）；
7、從edit選單中選取「lowerprimer」命令，在editlower視窗中輸入下游引物的序列；
8、在edit視窗的上角處，輸入相應的5位置；
9、選取「acceptandquit」命令；
如果想讓程式給出最佳退火溫度，在此時的對話方塊中輸入pcr產物的長度以及gc含量所佔百分比，一般哺乳動物的cdna序列中gc大約佔44%.
10、點選ok就可以在「analyze」選單中完成各種分析了。
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