pcr引物設計
pcr引物設計的目的是為了找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板dna序列。因此，引物的優劣直接關係到pcr的特異性與成功與否。
要設計引物首先要找到dna序列的保守區。同時應**將要擴增的片段單鏈是否形成二級結構。如這個區域單鏈能形成二級結構，就要避開它。
如這一段不能形成二級結構，那就可以在這一區域設計引物。
現在可以在這一保守區域裡設計一對引物。一般引物長度為15~30鹼基，擴增片段長度為100~600鹼基對。
讓我們先看看p1引物。一般引物序列中g+c含量一般為40%~60%。而且四種鹼基的分布最好隨機。
不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否則p1引物設計的就不合理。應重新尋找區域設計引物。
同時引物之間也不能有互補性，一般一對引物間不應多於4個連續鹼基的互補。
引物確定以後，可以對引物進行必要的修飾，例如可以在引物的5′端加酶切位點序列；標記生物素、螢光素、地高辛等，這對擴增的特異性影響不大。但3′端絕對不能進行任何修飾，因為引物的延伸是從3′端開始的。這裡還需提醒的是3′端不要終止於密碼子的第3位，因為密碼子第3位易發生簡併，會影響擴增的特異性與效率。
綜上所述我們可以歸納十條pcr引物的設計原則：
① 引物應用核酸系列保守區內設計並具有特異性。
② 產物不能形成二級結構。
③ 引物長度一般在15~30鹼基之間。
④ g+c含量在40%~60%之間。
⑤ 鹼基要隨機分布。
⑥ 引物自身不能有連續4個鹼基的互補。
⑦ 引物之間不能有連續4個鹼基的互補。
⑧ 引物5′端可以修飾。
⑨ 引物3′端不可修飾。
⑩ 引物3′端要避開密碼子的第3位。
pcr引物設計的目的是找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板dna序列。如前述，引物的優劣直接關係到pcr的特異性與成功與否。對引物的設計不可能有一種包羅永珍的規則確保pcr的成功，但遵循某些原則，則有助於引物的設計。
1.引物的特異性
引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續8個互補鹼基同源。
2.避開產物的二級結構區
某些引物無效的主要原因是引物重複區dna二級結構的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結構區域。用有關計算機軟體可以**估計mrna的穩定二級結構，有助於選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能（△g°）小於58.
6lkj/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用7-deaza-2′-脫氧gtp取代dgtp對擴增的成功是有幫助的。
3.長度
寡核苷酸引物長度為15~30bp，一般為20~27mer。引物的有效長度：ln=2（g+c）+（a+t+，ln值不能大於38，因為》38時，最適延伸溫度會超過taq dna聚合酶的最適溫度（74℃),不能保證產物的特異性。
4.g+c含量
g+c含量一般為40%~60%。其tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動溫度，一般高於tm值5~10℃。若按公式tm=4（g+c）+2（a+t）估計引物的tm值，則有效引物的tm為55~80℃，其tm值最好接近72℃以使復性條件最佳。
5.鹼基礎隨機分布
引物中四種鹼基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3個連續的g或c，因這樣會使引物在g+c富集序列區錯誤引發。
6.引物自身
引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會摺疊成髮夾狀結構牙引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。若用人工判斷，引物自身連續互補鹼基不能大於3bp。
7.引物之間
兩引物之間不應不互補性，尤應避免3′端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一對引物間不應多於4個連續鹼基的同源性或互補性。
8.引物的3′端
引物的延伸是從3′端開始的，不能進行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級結構可能，除在特殊的pcr（as-pcr）反應中，引物3′端不能發生錯配。
在標準pcr反應體系中，用2u taq dna聚合酶和800μmol/l dntp（四種dntp各200μmol/l）以質粒（103拷貝）為模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的迴圈引數擴增hiv-1 gag基因區的條件下，引物3′端錯配對擴增產物的影響是有一定規律的。a∶a錯配使產量下降至1/20，a∶g和c∶c錯七下降至1/100。引物a：
模板g與引物g：模板a錯配對pcr影響是等同的。
9.引物的5′端
引物的5′端限定著pcr產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′端修飾包括：
加酶切位點；標記生物素、螢光、地高辛、eu3+等；引入蛋白質結合dna序列；引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。
10.密碼子的簡併
如擴增編碼區域，引物3′端不要終止於密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發生簡併，會影響擴增特異性與效率。
特殊目的的引物設計將在有關章節討論。隨著人們對引物的認識，一些引物的計算機設計程式也應運而生，下面將討論有關引物計算機設計方法。
現有的引物設計軟體有primer5.0比較好。
PCR引物的設計原則
引物應用核酸系列保守區內設計並具有特異性。產物不能形成二級結構。引物長度一般在15 30鹼基之間。g c含量在40 60 之間。鹼基要隨機分布。引物自身不能有連續4個鹼基的互補。引物之間不能有連續4個鹼基的互補。引物5 端可以修飾。引物3 端不可修飾。引物3 端要避開密碼子的第3位。1.引物的特異性...
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