① 引物應用核酸系列保守區內設計並具有特異性。
② 產物不能形成二級結構。
③ 引物長度一般在15~30鹼基之間。
④ g+c含量在40%~60%之間。
⑤ 鹼基要隨機分布。
⑥ 引物自身不能有連續4個鹼基的互補。
⑦ 引物之間不能有連續4個鹼基的互補。
⑧ 引物5′端可以修飾。
⑨ 引物3′端不可修飾。
⑩ 引物3′端要避開密碼子的第3位。
1.引物的特異性
引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續8個互補鹼基同源。
2.避開產物的二級結構區
某些引物無效的主要原因是引物重複區dna二級結構的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結構區域。用有關計算機軟體可以**估計mrna的穩定二級結構，有助於選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能（△g°）小於58.
6lkj/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用7-deaza-2′-脫氧gtp取代dgtp對擴增的成功是有幫助的。
3.長度
寡核苷酸引物長度為15~30bp，一般為18~27mer。引物的有效長度：ln=2（g+c）+（a+t），ln值不能大於38，因為》38時，最適延伸溫度會超過taq dna聚合酶的最適溫度（74℃),不能保證產物的特異性。
含量 g+c含量一般為40%~60%。其tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動溫度，一般高於tm值5~10℃。若按公式tm=4（g+c）+2（a+t）估計引物的tm值，則有效引物的tm為55~80℃，其tm值最好接近72℃以使復性條件最佳。
上下游引物的gc含量不能相差太大。
5.鹼基隨機分布
引物中四種鹼基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3個連續的g或c，因這樣會使引物在g+c富集序列區錯誤引發。
6.引物自身
引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會摺疊成髮夾狀結構引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。若用人工判斷，引物自身連續互補鹼基不能大於3bp。
7.引物之間
兩引物之間不應具有互補性，尤應避免3′端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一對引物間不應多於4個連續鹼基的同源性或互補性。
引物二聚體及髮夾結構如果不可避免的話，應盡量使其△g值不要過高（應小於4.5kcal/mol）。否則易導致產生引物二聚體帶，並且降低引物有效濃度而使pcr 反應不能正常進行。
8.引物的3′端
引物的延伸是從3′端開始的，不能進行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級結構可能，除在特殊的pcr（as-pcr）反應中，引物3′端不能發生錯配。
在標準pcr反應體系中，用2u taq dna聚合酶和800μmol/l dntp（四種dntp各200μmol/l）以質粒（103拷貝）為模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的迴圈引數擴增hiv-1 gag基因區的條件下，引物3′端錯配對擴增產物的影響是有一定規律的。a∶a錯配使產量下降至1/20，a∶g和c∶c錯配下降至1/100。引物a：
模板g與引物g：模板a錯配對pcr影響是等同的。
9.引物的5′端
引物的5′端限定著pcr產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′端修飾包括：
加酶切位點；標記生物素、螢光、地高辛等；引入蛋白質結合dna序列；引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。
10.密碼子的簡併
如擴增編碼區域，引物3′端不要終止於密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發生簡併，會影響擴增特異性與效率。
11. 引物3′端不能選擇a，最好選擇t。
引物3′端錯配時，不同鹼基引發效率存在著很大的差異，當末位的鹼基為a時，即使在錯配的情況下，也能有引發鏈的合成，而當末位鏈為t時，錯配的引發效率大大降低，g、c錯配的引發效率介於a、t之間，所以3′端最好選擇t。
12. 引物5′ 端和中間△g值應該相對較高，而3′ 端△g值較低。
△g值是指dna 雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結構內部鹼基對的相對穩定性，△g值越大，則雙鏈越穩定。應當選用5′ 端和中間△g值相對較高，而3′ 端△g值較低（絕對值不超過9）的引物。引物3′ 端的△g 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構並引發dna 聚合反應。
（不同位置的△g值可以用oligo 6軟體進行分析）
13. 引物應具有特異性。
引物設計完成以後，應該對其進行blast檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。
關於blast（使用方法以後將會講解）的作用應該是通過比對，發現你所設計的這個引物，在已經發現並在genbank中公開的不物種基因序列當中，除了和你的目標基因之外，還有沒有和其他物種或其他序列當中存在相同的序列，如和你的目標序列之外的序列相同的序列，則可能擴出其他序列的產物，那麼這個引物的特異性就很差，從而不能用。
下面我們呼叫primer premier 5.0（以primer premier 5.0為例）， 講解它的特點和使用方法，目的是要達到能夠自己設計一對簡併引物、可以分析一段序列或基因的酶切位點。
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