oligo軟體使用方法介紹
心得yvette wrote:
對於作pcr的來說，最難的莫過於設計引物了，理論現在已經很多了，但是真正實踐起來是要付出一定的心智的，記得曾經看到某一位主任說他設計了上千對引物，從沒有失手的時候，真是讓我佩服得五體投地。
最近看了一下oligo6.0的使用說明，英文的，感覺有很多地方還是講得不很明白，比如 nested primers design 及 multiplex pcr primer design.
下面我先來講講普通的利用oligo 設計引物的方法吧：
1 從檔案選單開啟模板序列，當然，不是隨便什麼序列都可以開啟的，要有特定的格式，一般擴充套件名為 *.seq的序列可以直接開啟，或者就從檔案選單選擇new sequence開啟乙個空視窗，然後利用複製/貼上也可以匯入模板序列，或者直接在該視窗中寫，然後要開啟檔案選單旁邊的 accept 選單，選accept就可以了；這時候有三個視窗，重疊在一起，很不方便看，可以從window選單選tile，這樣，三個視窗就平行排列了。
2 從search選單選primers and probes，開啟了引物搜尋窗
3 點黑pcr下面的compatible pairs 前面的小圓孔
4 在oligonucleotide with gc clamp 及 eliminate false priming 前的小方格裡打上勾
5 如果在pcr中可能存在其他的模板，要想使所設計的引物與該模板不會形成錯配，可在 and continue above search in other files 的條目前方格中打勾，這時會出現乙個新的 select files窗，匯入可能會形成錯配的模板序列。點ok
6 點search ranges按鈕，輸入你想要的上游和下游引物在模板序列上的區間及想要的產物的長度，點ok
7 點parameters 即引物引數按鈕，一般將搜尋嚴謹性設為high，如果搜不到，再降低嚴謹性，另外，在adjust length to match tm's前的方格中打勾。點ok
8 點選ok開始自動搜尋
9 搜尋完成後，在search status視窗的下部選show:primer primers, 點ok
10 得到的引物可以根據位置、長度、退火溫度及gc含量進行排序（sort)
11 點選您所想要的就開啟了乙個視窗顯示引物的位置、退貨溫度、gc含量、pe(priming efficiency 引發效率)等。
12 從檔案選單點選"new database" ，然後從import選單點選 upper primer 和lower primer 就可以將您所需要的上下游引物序列匯入到資料庫中，至於如何生成引物報告單我就不甚了了，感覺這個功能不如primer premier好使。還希望知道如何使用的兄弟不吝賜教一下叻。
nested primer pairs search
與上述自動搜尋差不多，有一下幾點不同：
1 開啟search選單後，不要選定 「 and continue above search in other files 」
2 開啟parameters選單後，注意不要選定「 inverse pcr」 框 ，同樣選定「adjust length to match tm's」 框
3 開始搜尋後得到結果顯示在「primer pairs"視窗中，從analyze選單中選定multiplexing,得到乙個顯示所有搜尋到的引物在模板上的位置的視窗，直接在該視窗中選擇您所要的引物，在您所要的引物的小方塊上點選一下，positive strand primer 選定後就從紅色變成了綠色，negative strand primer 選定後就從藍色變成了綠色。先選擇巢式pcr的一對外引物，然後選擇一對內引物，選定後點選pairs就開啟了顯示您所選定引物的視窗
4 從檔案選單點選"new database" ，然後從import選單點選multiplexed primers就將您所選定的引物匯入到乙個資料庫中，儲存。
好像從export 選單可以生成order form, 但是我實在是太木了，這都大功告成了，到了最後又歇菜了。
還有很重要的功能如搜尋 consensus primer pair 和搜尋 unique primer pair 來擴增同源性的模板，比如後乙個應該就是設計擴增許多同源性很高的序列的保守區吧，我以為我已經找到了尚方寶劍了，可是三條序列試了一下，這三條序列經過 multiple align後有很長一段是保守的，您猜怎麼著，等了好幾分鐘，結果沒有找到，我又用十條序列，乾脆就宕機了，可能這一功能需要很大的記憶體才能使用。也許是我還沒有找到竅門，有知道的還請教教我。
多謝了！！！
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