柱色譜法中國藥品檢驗標準操作規範2023年版

柱色譜法

柱色譜法是將固定相裝在柱內，使樣品隨流動相沿乙個方向移動而達到分離的方法。（《中國藥典》2023年版二部附錄ⅴ c）附錄收載的柱色譜法包括吸附柱色譜法和分配柱色譜法。

1 吸附柱色譜法

吸附柱色譜法是利用色譜柱內吸附劑對於樣品中的各組分的吸附能力的差異以達到分離目的的方法。

1.1 吸附劑常用的有：氧化鋁、矽膠、聚醯胺、大孔吸附樹脂等。吸附劑的顆粒應盡可能大小均勻，除另有規定外，通常多採用直徑為70～150m的顆粒。

1.2 色譜柱色譜柱為內徑均勻，下端縮口或具活塞的硬質玻璃管，下端通常用棉花或玻璃纖維塞住，以防止吸附劑流失。

1.3 吸附劑的填裝

1.3.1 乾法將吸附劑均勻地一次加入至色譜柱中，振動管壁使其均勻下沉，開啟色譜柱下端活塞，沿管壁緩緩加入洗脫劑，待柱內吸附劑全部濕潤，且不再下沉為止，也可在色譜柱內加入適當的洗脫劑，旋開活塞，使洗脫劑緩緩滴出，然後自管頂端緩緩加入吸附劑，使其均勻地濕潤下沉，在管內形成鬆緊適度的吸附層。

裝柱完畢，關閉下端活塞。操作過程中應保持吸附層上方有一定量的洗脫劑。

1.3.2 濕法將吸附劑與洗脫劑混合均勻，採用攪拌方式除去其中氣泡，開啟下端活塞，緩緩傾入色譜柱中，必要時，振動管壁使氣泡排除，用洗脫劑將管壁吸附劑洗下，使色譜柱面平整。

待平衡後，關閉下端活塞，操作過程中應保持吸附層上方有一定量的洗脫劑。

1.4 供試品的加入

1.4.1 乾法加入法如供試品不易溶解於初始洗脫溶劑，可預先將供試品溶於易溶溶劑中，用少量吸附劑拌勻，採用加溫或揮幹方式除去溶劑，待乾燥後，再將帶有供試品的吸附劑加入至已裝好的吸附劑上面，加入洗脫劑。

1.4.2 濕法加入法先將色譜柱中洗脫劑放至與吸附劑面相齊，關閉活塞；用少量初始洗脫溶劑使供試品溶解，沿色譜管壁緩緩加入供試品溶液，應注意勿使吸附劑翻起（亦可在吸附劑表面放入面積相當的濾紙），待供試品溶液完全轉移至色譜管中後，開啟下端活塞，使液面與柱面相齊，加入洗脫劑。

1.5 洗脫除另有規定外，通常按洗脫劑洗脫能力大小，按遞增方式變換洗脫劑的品種與比例，分別分步收集流出液。收集流出液通常有兩種方式，一是等份收集（亦可用自動收集器），二是按變換洗脫劑收集。

1.6 注意事項

1.6.1 色譜柱的大小，吸附劑的品種和用量，以及洗脫時的流速，均按各品種項下的規定。

1.6.2 在裝柱及洗脫的操作過程中，應保持吸附層上方有一定量的洗脫劑，防止斷層和旁流。

1.6.3 通常應收集至流出液中所含成分顯著減少或不再含有時，再改變洗脫劑的品種或比例。

2 分配柱色譜法

分配柱色譜法是根據加到色譜柱上的待測物質在兩種不相混溶（或部分混溶）的溶劑（固定相、流動相）之間的分配係數的不同來分離各組分的方法。

2.1 載體（支援劑或擔體）載體只起負載固定相的作用，本身惰性，不能有吸附作用。常用的有：吸水矽膠、矽藻土、纖維素。

2.2 色譜柱同吸附柱色譜。

2.3 裝柱裝柱前需將載體與固定液充分混勻，裝柱，必要時用帶有平面的玻棒壓緊。

2.4 供試品的加入與洗脫

2.4.1 供試品如易溶於流動相中，用流動相溶解後移入色譜柱中載體上端，然後加流動相洗脫。

2.4.2 供試品如易溶於固定液中，用固定液溶解後加入少量載體混合，待溶劑揮散後，加到色譜柱上端，然後加流動相洗脫。

2.4.3 供試品如在上述兩項中均不溶解，則取其他易溶溶劑溶解，待溶劑揮散後，同2.4.2操作。

2.4.4 注意事項

2.4.4.1 流動相需先加固定液混合使之飽和，以避免洗脫過程中兩相分配的改變。

2.4.4.2 操作過程中，應保持吸附層上方有一定量的流動相，防止斷層和旁流。