30高效液相色譜法操作規程

2023-02-09 16:00:04 字數 3139 閱讀 7586

目的:建立高效液相色譜檢測法操作規程。

範圍:適用於高效液相色譜檢測法的操作。

職責:質檢室質檢員負責本規程的執行。

內容:高效液相色譜法是用高壓輸液幫浦將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩衝液等流動相幫浦入裝有固定相的色譜柱,經進樣閥注入供試品,由流動相帶入柱內,在柱內各成分被分離後,依次進入檢測器,色譜訊號由記錄儀或積分儀記錄。

1、對儀器的一般要求

所用的儀器為高效液相色譜儀。色譜柱的填充劑和流動相的組分應按各品種項下的規定。常用色譜柱填充劑有矽膠和化學鍵合矽膠,後者以十八烷基矽烷鍵合矽膠最為常用。

辛基矽烷鍵合矽膠次之,氰基或氨基鍵合矽膠也有使用。離子交換填充劑用於離子交換色譜;凝膠或玻璃微球等填充劑用於分子排阻色譜等。除另有規定外,柱溫為室溫,檢測器為紫外吸收檢測器。

在用紫外吸收檢測器時,所有流動相應符合紫外分光光度法(附錄iva)項下對溶劑的要求。

正文中各品種項下規定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器型別不得任意改變外,其餘如色譜柱內徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等,均可適當改變,以適應具體品種並達到系統適用性試驗的要求。一般色譜圖約於20分鐘內記錄完畢。

2、系統適用性試驗

按各品種項下要求對儀器進行適用性試驗,即用規定的對照品對儀器進行試驗和調整,應達到規定的要求;規定分析狀態下色譜柱的最小理論板數、分離度、重複性和拖尾因子。

(1)色譜柱的理論板數(n)在選定的條件下,注入供試品溶液或各品種項下規定的內標物質溶液,記錄色譜圖,量出供試品主成分或內標物質峰的保留時間tr(以分鐘或長度計,下同,但應取相同單位)和半峰高寬(wh/2),按n=5.54(tr/wh/2)2計算色譜柱的理論板數。如果測得理論板數低於各品種項下規定的最小理論板數,應改變色譜柱的某些條件(如柱長、載體效能、色譜柱充填的優劣等),使理論板數達到要求。

(2)分離度定量分板時,為便於準確測量,要求定量峰與其他峰或內標峰之間有較好的分離度,分離度(r)的計算公式為:

2(tr2- tr1)

r= w1+w2

式中 tr2為相鄰兩峰中後一峰的保留時間;

tr1為相鄰兩峰中前一峰的保留時間;

w1及w2為此相鄰兩峰的峰寬。

除另有規定外,分離芳應不大於1.5。

(3)重複性取各品種項下的對照溶液,連續進樣5次,除另有規定外,其峰面積測量值的相對標準偏差應不大於2.0%,也可按各品種校正因子測定項下,配製相當於80%、100%和120%的對照品溶液,加入規定量的內標溶液,配成3種不同濃度的溶液,分別進樣3次,計算平均校正因子,其相對標準偏著也不大於2.0%。

(4)拖尾因子為保證測量精度,特別當採用峰高法測量時,應檢查待測峰的拖尾因子(t)是否符合各品種項下的規定,或不同濃度進樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計算公式為:

w0.05h

t= 2d1

式中w0.05h 為0.05峰高處的峰寬;

d1為峰極大至峰前沿之間的距離。

除另有規定外,t應在0.95-1.05之間。

3、測定法

定量測定時,可根據供試品的具體情況採用峰面積法或峰高法。測定雜質含量時,須採用峰面積法。

(1)內標法加校正因子測定供試品中某個雜質或主要成分含量按各品種項下的規定,精密稱(量)取對照品和內標物質,分別配成溶液,精密量取各溶液,配成校正因子測定用的對照溶液,取一定量注入儀器,記錄色譜圖,測量對照品和內標物質的峰面積或峰高,按下式計算校正因子:

as/cs

校正因子(f)=

ar/cr

式中 as為內標物質的峰面積或峰高;

ar 為對照品的峰面積或峰高;

cs為內標物質的濃度;

cr 為對照品的濃度。

再取各品種項下含有內標物質的供試品溶液,注入儀器,記錄色譜圖,測量供試品中待測成分(或其雜質)和內標物質的峰面積或峰高,按下式計算含量:

ax含量(cx)=f·

as/cs

式中 ax為供試品(或其雜質)峰面積或峰高;

cx為供試品(或其雜質)的濃度。

f、as和cs的意義向上。

當配製校正因子測定用的對照溶液和含有內標物質的供試品溶液使用同乙份內標物質溶液時,則配製內標物質溶液不必精密稱(量)取。

(2)外標法測定供試品某個雜質或主成分含量

按各品種項下的規定,精密稱(量)取對照品和供試品,配製成溶液,分別精密取一定量,注入儀器,記錄色譜圖,測量對照品和供試品待測成分的峰面積(或峰高),按下式計算含量:

ax含量(cx)=cr

ar式中各符號意義同上。

(3)加校正因子的主成分自身對照法

測定雜質含量時,可採用加校正因子的主成分自身對照法,在建立方法時,按各品種項下的規定,精密標(量)取雜質對照品和待測成分對照品種各適量,配製測定雜質校正因子的溶液,進樣,記錄色譜圖,按上述(1)法計算雜質的校正因子,此校正因子可直接載入各品種正文中,用於校正雜質的實測峰面積。

測定雜質含量時,按品種項下規定的雜質限度,將供試品溶液稀釋成與雜質限度相當的溶液作為對照溶液,進樣,調節儀器靈敏度(以噪音水平可接受為限)或進樣量(以柱子不過載為限,)使對照溶液的主成分色譜峰高約達滿量程的10%-25%或其峰面積能準確積分(面積約為通常條件下滿量程峰積分值的10%)。然後,取供試品溶液和對照品溶液適量,分別進樣,供試品溶液的記錄時間除另有規定外,應為主成分保留時間的若干倍,測量**品溶液色譜圖上各雜質的峰面積,分別乘以相應的校正因子後與對照溶液主成分的峰面積比較,依法計算各雜質含量。

(4)不加校正因子的主成分自身對照法

當沒有雜質對照品時,可採用不加校正因子的主成分自身對照法,同上述(3)法配製對照溶液並調節儀器靈敏度後,取供試品溶液和對照溶液適量,分別進樣,前者的記錄時間除另有規定外,應為主成分保留時間的若干倍,測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峰面積並與對照溶液主成分的峰面積比較,計算雜質含量。

若供試品所含的部分雜質未與溶劑峰完全分離,則按規定先記錄供試品溶液的色譜圖i,再記錄等體積純溶劑的色譜圖ii,色譜圖i上雜質峰的總面積(包括溶劑峰),減去色譜圖ii上的溶劑峰面積,即為總雜質峰的校正面積,然後依法計算。

(5)面積歸一化法

由於峰面積歸一化法測定誤差大,因此,本法通常只能用於粗略考察供試品中的雜質含量,除另有規定外,一般不宜用於微量雜質的檢查,方法是測量各雜質峰的面積和色譜釁上除溶劑峰以外的總色譜峰面積,計算各峰面積佔總峰面積的百分率,即得。

由於微量注射器不易精確控制進樣量,當採用外標法測定供試品中某雜質或主成分含量時,以定量環進樣為好。

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