分發部門：
1 目的
建立高效液相色譜法檢驗程式
2 範圍
本程式適用於高效液相色譜法檢驗標準操作
3 職責
3.1qc人員：嚴格按本程式操作
3.2qc主管：嚴格按本程式檢查
4 內容
4.1 定義及概述
4.1.1 高效液相色譜法是一種現代液體色譜法，其基本方法是將具一定極性的單一溶劑或不同比例的混合溶液作為流動相，用高壓輸液幫浦將流動相注入裝有填充劑的色譜柱，注入的供試品被流動相帶入柱內進行分離後，各成分先後進入檢測器，用記錄儀或資料處理裝置記錄色譜圖或進行資料處理，得到測定結果。
由於應用各種性質的微粒填料和加壓的液體流動相，本法具有分離效能高，分析速度快的特點。
4.1.2 高效液相色譜法適用於能在特定填充劑的色譜柱上進行分離的藥品的分析測定，特別是多組分藥品的測定、雜質檢查和大分子物質的測定。
有的藥品需要在色譜分離前或後經過衍生化反應，方能進行分離或檢測。常用的色譜柱填充劑有：矽膠用於正相色譜；化學鍵合固定相，根據鍵合的基團不同可用於反相或正相色譜，其中最常用的是十八烷基矽烷（又稱ods）鍵合矽膠，可用於反相色譜或離子對色譜離子交換填料，用於離子交換色譜，是有一定孔徑的大孔填料，用於排阻色譜。
4.1.3 儀器的組成和一般要求：
4.1.3.1 儀器的組成：高壓輸液幫浦、色譜柱、檢測器、積分儀、印表機。
4.1.3.2 對儀器的一般要求：
——所用的儀器為高效液相色譜儀。色譜柱的填充劑和流動相的組分按各品種項下的規定。常用的色譜柱填充劑有矽膠和化學健合矽膠，後者以十八烷基矽烷鍵合矽膠最為常用，辛基矽烷鍵合矽膠次之，氰基或氨基鍵合矽膠也有使用。
離子交換填充劑用於離子交換色譜；凝膠或玻璃微球等填充劑用於分子排阻色譜等。除另有規定外，柱溫為室溫，檢測器為紫外吸收檢測器。
——在用紫外吸收檢測器時，所用流動相應符合紫外分光光度法項下對溶劑的要求。（紫外分光光度法項下對溶劑的要求：用1cm石英吸收池盛溶劑，以空氣為空白（即空白光路中不置任何物質），測定其吸收度。
溶劑和吸收池所吸收度，在220～240nm範圍內不得超過0.40，在241～250nm範圍內不得超過0.20，在251～300nm範圍內不得超過0.
10，在300nm以上時不得超過0.05。）
——正文中各品種項下規定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器型別不得任意改變外，其餘如色譜柱內徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變，以適應具體品種並達到系統適用性試驗的要求。
——儀器各部件應能正常工作，管路為無死體積鏈結，流路中無堵塞或漏液，在設定的檢測器靈敏度條件下，色譜基線噪音和漂移應能滿足分析要求。
4.2 操作前的準備：
4.2.1 流動相的製備：
用高純度的試劑配製流動相，必要時照紫外分光光度法進行溶劑檢查，應符合要求；水應為新鮮製備的高純水。對規定ph值的流動相，應使用精密ph計進行調節。配製好的流動相應通過0.
44μm適宜的濾膜濾過，用前脫氣。應配製足量的流動相及時待用。
4.2.2 供試溶液的配製：
供試品用規定溶劑配製成供試溶液。定量測定時，對照品溶液和樣品供試溶液均應分別配製2份。供試溶液在注入色譜儀前，一般應經0.
44μm適宜的濾膜濾過。必要時，在配製供試溶液前，樣品需經提取淨化，以免對色譜系統產生汙染。
4.2.3 檢查上次使用記錄和儀器狀態：
檢查色譜柱是否適用於本次試驗，色譜柱進出口位置是否與流動相的流向一致，原儲存溶劑與現用流動相能否互溶，流動相的ph值與該色譜柱是否相適應，儀器是否完好，儀器的各開關位置是否處於關斷的位置。
4.2.4 系統適用性試驗：
按各品種項下要求對儀器進行適用性試驗，即用規定的對照品對儀器進行試驗和調整，應達到規定的要求，或規定分析狀態下色譜柱的最小理論板數、分離度、重複性和拖尾因子。
4.2.5 色譜柱的理論板數（n）在先定的條件下，注入供試品溶液或品種項下規定的內標物質溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分或內標物質峰的保留時間tr（以分鐘或長度計，下同，但應取相同單位）和半峰高寬（wh/2），按n=5.
54（tr/wh/2）2計算色譜柱的理論板數。如測得理論板數低於各品種項下規定的最小理論板數，應改變色譜柱的某些條件（如信長、載體效能、色譜柱允填的優劣等），使理論板數達到要求。
4.2.6 分離度：分量分析時，為便於準確測量，要求定量峰與其他峰或內標峰之間有較好的分離度。分離度（r）的計算公式為：
r =式中 tr2為相鄰兩峰中後一峰的保留時間；
tr1為相鄰兩峰中前一峰的保留時間tr1 tr2
w1及w2為此相鄰兩峰的峰寬w1 w2
除另有規定外，分離度應大於1.5。
4.2.7 重複性：
取各品種項下的對照溶液，連續進樣5次，除另有規定外，其峰面積測量值的相對標準偏差應不大於2.0%。也可按各品種校正因子測定項下，配製相當於80%、100%和120%的對照品溶液，加入規定量的內標溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別進樣3次，計算平均校正因子，其相對標準偏差也應不大於2.
0%。4.2.8 拖尾因子：
為保證測量精度，特別當採用峰高法測量時，應檢查待測峰的拖尾因子（t）是否符合各品種項下的規定，或不同濃度進樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計算公式為：
t=式中 w0.05h為0.05峰高處的峰寬；
w0.005hd1為峰極大至峰前沿之間的距離。
d1除另有規定外，t應在0.95～1.05之間。
4.3 測定方法：
定量測定時，可根據供試品的具體情況採用峰面積法成峰高法。測定雜質含量時，須
採用峰面積法。
4.3.1 內標法加校正因子測定供試品中某個雜質或主成分含量：
4.3.1.
1 測定方法：按各品種項下的規定，精密稱（量）取對照品和內標物質，分別配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子測定用的對照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖。
測量對照品和內標物質的峰面積或峰高。
4.3.1.2 按下式計算校正因子：
校正因子（f）=
式中：as為內標物質的峰面積或峰高；
ar為對照品的峰面積或峰高；
cs為內標物質的濃度；
cr為對照品的濃度。
4.3.1.3 含量測定：再取各品種項下含有內標物質的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分（或其雜質）和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算含量：
含量（ｃx）＝
式中 ax為供試品（或雜質）峰面積或峰高；
x為供試品（或雜質）的濃度；
f、as和cs的意義同（3.7.1.2公式）
4.3.1.4 稱量要求：當配製校正因子測定用的對照溶液和含有內標物質的供試品溶液使用同乙份內標物質溶液時，則配製內標物質溶液不必精密稱（量）取。
4.3.2 外標法測定供試品中某個雜質或主成分含量：
4.3.2.1 按各品種項下的規定，精密稱（量）取對照品的供度品，配製成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品和供試品待測成分的峰面積（或峰高）。
4.3.2.2 按下式計算含量：
含量（cx）=
式中符合意義：cx為供試品（或其雜質）的濃度：mg/ml；
ax為供試品（或其雜質）峰面積或峰高；
cr為對照品的濃度：mg/ml；
ar為對照品的峰面積或峰高。
4.3.3 加校正因子的主成分自身對照法：
4.3.3.
1 測定雜質含量時，可採用加校正因子的主成分身身對照法。在建立方法時，按各品種項下的規定，精密稱（量）取雜質對照品和待測成分對照品各適量，配製測定雜質校正因子的溶液，進樣，記錄色譜圖，按上述3.7.
1法計算雜質的校正因子。此校正固子可直接載入各品種正文中，用於校正雜質的實則峰面積。
4.3.3.
2 測定雜質含量時，按各品種項下規定的雜質限度，將供試品溶液稀釋成與雜質限度相當的溶液作為對照溶液，進樣，調節儀器靈敏度（以噪音水平可接受可限）或進樣量（以柱子不過載為限），使對照溶液的主成分色譜峰高約達滿量程的10%~25%或其峰面積能準確積分（面積約為通常條件下滿量程峰積分值的10%）。然後，取供試品溶液和對照品溶液適量，分別進樣，供試品溶液的記錄時間除另有規定外，應為主成成保留時間的若干倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峰面積，分別乘以相應的校正因子後與對照溶液主成分的峰面積比較，依法計算各雜質含量。
4.3.4 不加校正因子的主成分自身對照法：
4.3.4.
1 當沒有雜質對照品時，可採用不加校正因子的主成分自身對照法。同上述配製對照溶液並調節儀器靈敏度後，取供試品溶液和對照溶液適量，分別進樣，前者的記錄時間除另有規定外，應為主成分保留時間的若干倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峰面積並與對照溶液主成分的峰面積比較，計雜質含量。
4.7.4.
2 若供試品所含的部分雜質未與溶液峰完全分離，則按規定先記錄供試品溶液的色譜圖ⅰ，再記錄等體積純溶劑的色譜圖ⅱ。色譜圖ⅰ上雜質峰的總面積（包括溶劑峰），減去色譜圖ⅱ上的溶劑峰面積，即為總雜質峰的校正面積。然後依法計算。
4.3.5 面積歸一化法：
4.3.5.
1 由於峰面積歸一化法測定誤差大，因此，本法通常只能用於粗略考察供試品中的雜質含量。除另有規定外，一般不宜用於微量雜質的檢查。方法是測量各雜質峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計算各峰面積佔總峰面積的百分率，即得。
30高效液相色譜法操作規程
目的 建立高效液相色譜檢測法操作規程。範圍 適用於高效液相色譜檢測法的操作。職責 質檢室質檢員負責本規程的執行。內容 高效液相色譜法是用高壓輸液幫浦將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑 緩衝液等流動相幫浦入裝有固定相的色譜柱，經進樣閥注入供試品，由流動相帶入柱內，在柱內各成分被分離後，依次進...
第十八章高效液相色譜法章節小結
一 主要內容 1 基本概念 1 化學鍵合相 利用化學反應將有機基團鍵合在載體表面形成的固定相。2 化學鍵合相色譜法 以化學鍵合相為固定相的色譜法。3 正 反 相色譜法 流動相極性小 大 於固定相極性的液相色譜法。4 抑制型 雙柱 離子色譜法 用抑制柱消除流動相的高電導本底，以電導為檢測器的離子交換色...
高效液相色譜法測定苯甲酸的不確定度分析報告
食品 金標特級生抽 中苯甲酸含量測量不確定度評定報告 報告編號 nt bq 2010 02 編制日期 年月日 批准日期 年月日 濟寧耐特食品 品管部實驗室 食品 金標特級生抽 中苯甲酸含量測定 測量不確定度評定報告 一 概述 1 樣品編號 100771 環境條件 溫度20 相對濕度40 2 檢測儀器...