實驗七紫外吸收法測蛋白質濃度
姓名：週超
同組者：劉炳煜
班級：11級生命基地
學號：201100140067
【實驗目的】
1、 了解紫外吸收法測蛋白質濃度的原理
2、 熟悉紫外分光光度計的使用
【實驗原理】
蛋白質組成中常含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm波長處有最大吸收峰，一定濃度範圍內其濃度與吸光度成正比，故可用紫外分光光度計通過比色來測定蛋白質的含量。
由於核酸在280nm波長處也有光吸收，對蛋白質的測定有一定的干擾作用，但核酸的最大吸收峰在260nm處。如同時測定260nm的光吸收，通過計算可以消除其對蛋白質測定的影響。因此如溶液中存在核算時必須同時測定280nm及260nm的吸光值，方可通過計算測得溶液中的蛋白質弄濃度。
【實驗材料】
一、器材
uv-9100型紫外分光光度計
試管7個
移液管搖勻器
洗瓶二、試劑
標準酪蛋白 1mg/ml
樣品血清（稀釋100倍）
蒸餾水【實驗步驟】
一、直接測定法
1、在紫外分光光度計上，將樣品血清溶液小心盛於石英比色皿中，以水為對照，測得280nm和260nm兩種波長的吸光度（a280nm及a260nm）
2、當a280nm/a260nm﹤1.5時，將280nm及260nm波長處測得的吸光度按下列公式計算蛋白質濃度：
c=1.45 a280nm- 0.74a260nm
式中 c：蛋白質質量濃度（mg/ml）
3、當a280nm/a260nm﹥1.5時，將280nm及260nm波長處測得的吸光度按下列公式計算蛋白質濃度：
血清蛋白質量濃度（mg/ml）=（a280nm/6.3）×10
二、標準曲線法
取7支試管，按下錶加入試劑。
加畢，混勻，用紫外分光光度計測a280nm，以吸光度為縱座標，蛋白質濃度為橫座標，對1-7號作圖，測樣品管的a280nm，對照標準曲線求得蛋白質濃度。
【實驗結果】
一、直接測定法
1、c=（1.45 a280nm- 0.74a260nm）*2*100=72.4mg/ml
2、c=[（a280nm/6.3）*10]*2*100=128.0 mg/ml
二、標準曲線法
c=0.403/0.8424*2*100=95.6mg/ml
【結果分析】
三種計算測定和計算方法得出三個數值：
使用公式c=（a280nm/6.3）*10計算得到的數值準確性最差，因為實驗資料不滿足該公式的使用條件a280nm/ a260nm〉1.5。
使用公式c=1.45 a280nm- 0.74a260nm計算得到的數值準確性最高，因為實驗資料滿足該公式的使用條件a280nm/ a260nm〈1.
5，同時，還消除了核酸對實驗資料的影響。
使用標準曲線法得到的數值較使用公式c=1.45 a280nm- 0.74a260nm計算得到的數值準確性稍差，標準曲線法僅使用了a280nm的資料，但因為核酸在280nm波長處也有光吸收，會對實驗結果造成干擾，造成結果偏大。
【思考討論】
1、紫外分光光度法測定蛋白質含量的方法的優缺點：
優點：簡單、靈敏、快速、高選擇性。不消耗樣品，測定後仍能**使用；低濃度的鹽和大多數緩衝液都不干擾測定，適合柱層析洗脫液的快速連續檢測。
缺點：儀器昂貴，不同的蛋白質的紫外吸收是不相同的，測定結果存在著一定的誤差。準確度較差，干擾物質多；在用標準曲線法測定蛋白質含量時，對那些與標準蛋白質中酪蛋白和色氨酸含量差異大的蛋白質，有一定的誤差；樣品中若含有嘌呤、嘧啶及核算等吸收紫外光的物質，會出現較大的干擾；測定時受樣品的ph影響較大。
2、 直接測定法與標準曲線法比較
直接測定法：操作簡單，快捷方便，不消耗樣品，樣品扔能**利用；可以有效消除核酸的干擾，實驗結果較準確，它還適用於硫酸銨或其他鹽類物質混雜的情況。但是不同蛋白質及核酸的光吸收率不完全相同，還是會產生些許誤差。
標準曲線法：簡單常用，但是實驗結果準確性較差，干擾因素多，比如酪蛋白和色氨酸含量的差異、嘌呤、嘧啶及核算等都會對實驗結果造成干擾。
2、注意事項:
（1）製作標準曲線時，加樣一定要準確。
（2）測量吸光度時，比色皿要保持潔淨，切勿用手玷汙其光面。
（3）注意直接測定法中公式的使用條件。
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