姓名： 許梨梨
學號： 3120100024
專業年級： 2013級醫學影像學
組別： 第3實驗室
生物化學與分子生物學實驗教學中心
一、實驗目的
1.掌握薄層層析法的一般原理。
2.掌握氨基酸薄層層析法的基本操作技術。
3.掌握如何根據移動速率（rf值）來鑑定被分離的物質（即氨基酸混合液）。
二、實驗原理
（一）薄層層析法
薄層層析法是色譜分析技術的一種，一般將固體吸附劑塗佈在平板上形成薄層作為固定相。當液體（展開溶劑）在固定相上流動時，由於吸附劑對不同氨基酸的吸附力不一樣，不同氨基酸在展開溶劑中的溶解度不一樣，點在薄板上的混合氨基酸樣品隨著展開劑的移動速率也不同，因而能夠將樣品各組分分離開。即通過吸附-解吸-再吸附-再解吸的反覆進行，而將樣品各組分分離開來。
吸附薄層中常用的吸附劑為氧化鋁和矽膠。層析用矽膠是一種多孔性物質，它的矽氧環交鏈結構表面上密布極性矽醇基，這種極性的矽醇基能和許多化合物形成氫鍵而產生吸附。
本實驗採用矽膠吸附薄層層析。矽膠吸附薄層層析的特點：1.
矽膠的吸附能力比氧化鋁稍弱，其吸附活性也與含水量呈負性相關。2.矽醇基顯較弱的酸性，因而，矽膠只能用於中性、或酸性成分的分離，鹼性成分不能用它分離。
3.矽膠的活化溫度通常為105℃－110℃，不能過高。
（二）氨基酸與茚三酮的顯色反應
茚三酮水化後生成水化茚三酮，它與氨基酸發生羧基反應生成還原茚三酮、氨基酸，與此同時。還原茚三酮又與氨基茚三酮縮合生成紫紅色化合物而使氨基酸斑點顯色。
（三）相對遷移率—rf值的計算
混合氨基酸被分離後在薄層層析圖譜上的位置用相對遷移率—rf值（rate of flow）來表示。
層析中，物質沿溶劑運動方向遷移的距離與溶液前沿的距離之比為rf值。
由於物質在一定溶劑中的分配係數是一定的，故移動速率（rf值）也是恆定的，因此可以根據rf值來鑑定被分離的物質。
三、材料與方法：
（一）實驗材料
1.分析樣品：（1）混合氨基酸溶液
2）氨基酸的異丙醇溶液：丙氨酸、精氨酸、甘氨酸。
2．試劑：（1）吸附劑：矽膠；
（2）黏合劑：0.5%的羧甲基纖維素鈉；
（3）展層-顯色劑：為正丁醇、乙醇、茚三酮、丙酮、蒸餾水混合液；
3.儀器及器材：（1）層析板（5*15cm）；（2）小燒杯及藥匙；（3）量筒（10ml）；
（4）小尺子和鉛筆；（5）毛細玻璃管；（6）層析缸；（7）烘箱；（8）天平
（二）實驗方法
1.實驗流程：
2.操作步驟 ：
四、結果與討論：
（一）結果
1.實驗現象
（1）層析時，能清楚地看到展層-顯色劑在層析板上運動的痕跡。通過計時及觀察展層劑前沿的位置，可以大致看出展層劑前沿的移動速率隨前沿所處高度的增加而減緩。當前緣到達層析板中間部位時，能觀察到展層劑前沿移動的速率變得非常緩慢。
（2）層析過程中層析板上沒有顯色現象。開啟層析缸能聞見濃烈的丙酮味。
（3）在烘箱內烘烤10分鐘左右時，即可見層析板上開始顯現紫紅色的斑點，並且斑點顏色在一定時間範圍內隨時間的增加而加深。丙氨酸的斑點最高，顏色深淺介於甘氨酸和精氨酸之間；甘氨酸斑點位置次之，顏色最淺；精氨酸斑點最低，顏色最深；混合氨基酸處有3個界限較分明的斑點，分別標記為混合點1、2、3。混合點1和丙氨酸位置大致等高，混合點2和甘氨酸的位置大致等高，混合點3和精氨酸的位置大致等高。
結果如圖1所示。
(4)製板時，在自然晾乾情況下，原本糊狀的固定相逐漸變成固體。
圖 1氨基酸薄層層析結果
2.實驗資料
表 1 各氨基酸色斑中心至樣品原點中心距離及溶劑前緣至樣品中心距離記錄
單位：cm
3.結果計算與分析
根據公式 rf= 計算各斑點的rf值，結果記錄見表2。
表 2氨基酸薄層層析的結果記錄表
層析板上顯現出紫紅色的較清晰的斑點，並且混合氨基酸處分離出3個界限較分明的斑點。
觀察各斑點的位置，可見混合點1和的丙氨酸位置大致等高，混合點2和甘氨酸的位置大致等高，混合點3和精氨酸的位置大致等高。可知混合氨基酸被成功分離，並可初步判斷混合點1、2、3依次為丙氨酸、甘氨酸、精氨酸。
通過比較表2的資料，可以進一步確定混合點1、2、3分別為丙氨酸、甘氨酸、精氨酸。
綜上所述，本次實驗得出混合氨基酸溶液中含有丙氨酸、甘氨酸、精氨酸。實驗成功。
（二）討論
1.調漿時應充分攪拌，使混合物呈均勻的糊狀，若沒有攪拌充分使混合物中含有粉塊狀物質，則會影響層析板吸附力。攪拌動作應較緩慢，過快矽膠粉會被氣流吹出來，當矽膠粉丟失過多時會使混合物過稀，一方面會因水分過多，另一方面會使得層析板變薄，兩者都會導致其吸附力下降。
2.塗佈時應選擇平整潔淨無油汙的玻璃板，減少干擾因素，並讓整個玻璃板都均勻地塗滿矽膠漿，包括角落，一方面能擴大展層板的有效面積，並能使整個層析板有乙個均勻的吸附力。可通過輕輕敲打玻璃板使糊狀物在玻璃板上分布更為均勻。
最後要放置在水平面上晾乾。
3.點樣時應讓每個點保持一定間隔，防止層析時發生交叉或拖尾，不能得到很好的分離。使用毛細管時可讓毛細管輕輕地在標記點上停留1s左右，觀察加樣點，當其直徑擴大至將近2mm時停止加樣，這樣可以避免因接觸時間過短而增加加樣次數。
不宜將毛細管頭抵在薄板上，這樣管內液體很難流下，輕輕接觸薄板即可。使加樣原點擴散直徑不超過2mm，是為防止層析時發生交叉或拖尾。為控制變數，每個點加樣時都要使用完毛細管內的液體，必要時重複加樣，重複加樣要等上一滴晾乾時才能繼續加下一滴，這樣才能防止直徑擴張。
4. 用鉛筆做標記時力動作太大會損壞層析板，動作太小標記會不明顯，應控制力道。劃破展層板會改變展層板在該點附近的吸附力，使氨基酸遷移受阻。
並且點樣時保證讓樣點的圓心在畫好的標準線上，便於距離的測量。
5.展層時層析板擺放位置可適當降低，減小和水平面的夾角，能使展開劑移動地更遠，能使混合氨基酸更好地分離。但展層-顯色劑的液面必須低於點樣線，否則會使樣點溶於溶劑中，導致無法展層或參與展層的氨基酸過少。
6.烘乾前都要注意不要用手接觸展層板，因為手上會有汗液，而汗液中又含有較多蛋白質，若在烘乾前接觸層析板可能會使雜質蛋白質和茚三酮反應，最後在烘乾時顯色，干擾氨基酸的薄層層析的結果。
7.層析時間超過30min，雖然這時候展開劑前沿離層析板的中線仍有一小段距離，但此時展開劑移動已經相當緩慢，可以停止層析。並且取出層析板時應及時標記下展開劑前沿的位置。
8.顯色所用烘乾溫度以70℃為宜，過高易造成層析板矽膠裂開。烘乾時間大致為15分鐘，這時各斑點顯色都已比較明顯，及時取出能節省實驗時間。
9.計算rf值時，發現混合點1、2、3的數值和標準氨基酸溶液的數值存在一定偏差，並且全部是偏小的，一方面可能因為讀數存在偶然性，另一方面可能因為此處層析板稍薄，導致吸附力偏低。
五、複習思考題
1.矽膠的吸附力與含水量的問題
矽膠的吸附力與含水量呈負相關，含水量越多，矽膠吸附力越低。因為矽膠是通過其表面的極性矽醇基和許多化合物形成氫鍵而產生吸附的，水為極性小分子，會和矽醇基形成氫鍵，使得空餘的矽醇基減少，因而對其他化合物而言，矽膠的可結合位點就相應減少，表現出來吸附力降低。
2.吸附實驗中吸附劑的選擇根據
吸附劑的選擇首先要考慮到待分離物質的特性，要針對性地選擇高效的吸附劑。如待分離物質為鹼性時，則不宜選用矽膠，因為矽醇基顯較弱的酸性。同時要考慮到經濟、操作及安全問題，要選擇**便宜，使用簡單方便並且對人體對環境等沒有傷害的吸附劑。
3.氨基酸紙層析，兩者有何區別
薄層層析以玻璃作為載體，玻璃質地堅硬，能讓固定相平整地鋪在上面，這樣使得展層更為方便，而紙層析因為是以紙為載體，紙張易變形，所以要採用圓形濾紙並通過燈芯的抽吸作用讓展層劑均勻地在紙張上流動，操作較繁瑣，同時紙層析更易產生誤差。
薄層層析選用固體的矽膠為固定相，紙層析選用液體水為固定相，二者操作方法不同，前者要先將固定相塗佈在玻璃板上製成層析板，而後者將固定相和流動相混合，同時在展層時使用，省去了製作層析板消耗的大量時間。這使得紙層析操作可重複性高。
薄層層析是可以將層析產物通過一定手段提取出來的，而紙層析不能。
生化大實驗報告
實驗一多酚氧化酶 ppo 的分離與提取 一 實驗目的 1 本實驗以馬鈴薯為主要的實驗材料，通過細胞組織破碎勻漿 過濾 離心 硫酸銨沉澱 透析等步驟獲得ppo的粗酶液。2 通過本項實驗，學習和了解蛋白質的提取 分離的基本原理和方法，掌握相關儀器裝置的操作使用，以及蛋白質的提取 分離的系統技術。二 實驗...
生化實驗報告作死版
蛋白質定量分析實驗 實驗一雙縮脲法測定蛋白質含量 實驗原理 在蛋白質分子中含有許多肽鍵，與雙縮脲結構類似。含有兩個以上肽鍵的蛋白質可與雙縮脲試劑發生顯色反應 雙縮脲反應 在一定濃度範圍內，顏色的深淺與蛋白質濃度成正比。故可用比色法測定蛋白質含量。雙縮脲法的靈敏度為1 20mg 實驗結果 標準蛋白質溶...
生化實驗報告 白一良
正式報告 食品中蛋白質含量測定 凱氏定氮法 姓名 白壹良 學號 080800201 組別 第17 組 同組人姓名 周亞凱鍾晉 指導老師 張雯 實驗日期 2010年4月27日 繳交報告日期 2010年5月4日 食品中蛋白質含量測定 摘要 氮元素是蛋白質區別於醣類，脂肪等的特徵，測出生物樣品中的含氮量即...