山東大學實驗報告 2023年 12月 4 日
科目：微生物學實驗題目：微生物鑑定常用的生理生化試驗姓名：丁志康
一、 目的要求
1.證明不同微生物對各種有機大分子的水解能力不同，從而說明不同微生物有著不同的酶系統。
2.掌握進行微生物大分子水解試驗的原理和方法。
3.了解糖發酵的原理和在腸道細菌鑑定中的重要作用。
4.掌握通過糖發酵鑑別不同微生物的方法。
5.了解imvic反應的原理及其在腸道細菌鑑定中的意義和方法。
二、 基本原理
1、生物對大分子的澱粉、蛋白質和脂肪不能直接利用，必須靠產生的胞外酶將大分子物質分解才能被微生物吸收利用。胞外酶只要為水解酶，通過加水裂解大的物質為較小的化合物，使其能被運輸至細胞內。如澱粉酶水解澱粉為小分子的糊精、雙醣和單醣；脂肪酶水解脂肪為甘油和脂肪酸；蛋白酶水解蛋白質為氨基酸等。
這些過程均可通過觀察細菌菌落周圍的物質變化來證實；澱粉遇碘液會產生藍色，但細菌水解澱粉的區域，用碘測定不在產生藍色，表明細菌產生澱粉酶。脂肪水解後產生脂肪酸可改變培養基的ph，使ph降低，加入培養基的中性紅指示劑會使培養基從淡紅色變成深紅色，說明胞外存在著脂肪酶。
2、糖發酵試驗是常用的鑑別微生物的生化反應，在腸道細菌的鑑定上尤為重要。絕大多數細菌都能利用醣類作為碳源和能源，但是它們在分解醣類物質的能力上有很大的差異。有些細菌能分解某種糖產生有機酸（如乳糖、醋酸、丙酸等）和氣體（如氫氣、甲烷、二氧化碳的等）；有些細菌只產酸不產氣。
例如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產酸並產氣；傷寒桿菌分解葡萄糖產酸不產氣，不能分解乳糖；普通變形桿菌分解葡萄糖產酸產氣，不能分解乳糖。發酵培養基含有蛋白腖，指示劑（溴甲酚紫），倒置的德漢氏小管和不同的醣類。當發酵產酸時，溴甲酚紫指示劑可由紫色（ph6.
8）變為黃色（ph5.2）。氣體的產生可由倒置的德漢氏小管中有無氣泡來證明。
3、imvic反應是吲哚試驗、甲基紅試驗、伏-普試驗和檸檬酸試驗4個試驗的首字母縮寫。這四個實驗主要是用來快速鑑別大腸桿菌和產氣桿菌，多用於水的細菌檢查。
（1）吲哚試驗：某些細菌有色氨酸酶，能分解蛋白腖中的色氨酸形成吲哚（靛基質），吲哚能與對二甲基氨基苯甲醛作用生成玫瑰吲哚而呈紅色。
（2）甲基紅試驗：某些細菌在糖代謝過程中，分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸進一步被分解成為甲酸、乙酸、琥珀酸等，使培養基ph下降至4.5以下，加入甲基紅指示劑可呈紅色。
如細菌分解葡萄糖產酸量少，或產生的酸進一步轉化為其他物質（如醇、醛、酮、氣體和水），培養基ph在5.4以上，加入甲基紅指示劑呈橘黃色。本試驗常與v-p試驗一起使用，因為前者呈陽性的細菌，後者通常為陰性。
（3）伏-普（二乙醯）試驗：某些細菌能發生如下轉換：葡萄糖→丙酮酸（脫羧）→乙醯甲基甲醇→2，3—丁烯二醇，在有鹼存在時氧化成二乙醯，後者和腖中的胍基化合物起作用產生粉紅色的化合物。
本試驗目的在於測定細菌產生乙醯甲基甲醇的能力。
（4）檸檬酸試驗：當細菌利用銨鹽作為唯一氮源，並利用檸檬酸鹽作為唯一碳源時，若細菌能利用這些鹽作為氮源和碳源而生長，則能利用檸檬酸鈉產生碳酸鹽，從而與利用銨鹽產生的氨反應，形成nh4oh，使培養基呈鹼性，使指示劑溴麝香草酚藍（btb）由淡綠轉為深藍。
三、 器材
1.菌種:枯草芽孢桿菌，大腸桿菌，產氣桿菌，銅綠假單胞菌，普通變形桿菌，金黃色葡萄球菌。
2.培養基:固體澱粉培養基，蛋白腖水培養基，葡萄糖蛋白腖水培養基，葡萄糖發酵培養基，乳糖發酵培養基。
3.溶液或試劑:革蘭氏染色用盧戈氏碘液，甲基紅試劑，試劑，吲哚試劑。
4.儀器或其他用具:無菌平板，無菌試管，接種環，接種針，試管架，酒精燈，小玻璃管。
四、 操作步驟
（一） 澱粉水解試驗
(1)將固體澱粉培養基融化後冷卻至50℃左右，無菌操作製成平板。
(2)用記號筆在平板底部劃成四部分。
(3)將枯草芽孢桿菌，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，銅綠假單細胞菌分別在不同的部分點點接種，在平板的反面分別在四部分寫上菌名。
(4)將平板倒置在37℃溫箱中培養24h。
(5)觀察各種細菌的生長情況，將平板開啟蓋子，滴入少量盧戈氏碘液於平皿中，輕輕旋轉平板，使碘液均勻鋪滿整個平板。如菌苔周圍出現無色透明圈，說明澱粉已被水解，為陽性。透明圈的大小可初步判斷該菌水解澱粉酶能力的強弱，即產生胞外澱粉酶活力的高低。
（二） 糖發酵試驗
1.用記號筆在各試管外壁上分別標明發酵培養基名稱和所接種的細菌菌名。
2.取葡萄糖發酵培養基試管3支，同樣分別接入大腸桿菌，普通變形桿菌，第三支不接種，作為對照。
在接種後，輕緩搖動試管，使其均勻，防止倒置的小管進入氣泡。
3.將接種過和作為對照的6支試管均置37℃培養24~48h。
4.觀察各試管顏色變化及德漢氏小管中有無氣泡。
（三） imvic試驗
（1） 接種與培養
用接種環分別取一些大腸桿菌和產氣桿菌的菌種，接入五隻葡萄糖蛋白腖水培養基中以及三隻蛋白腖水培養基中，分別貼上標籤註明培養基名稱以及菌種名稱，放入37℃培養基中培養48h。
（2） 結果觀察
1、 吲哚試驗：於培養48小時後的蛋白腖水培養基中滴入3~4滴乙醚，搖動數次，靜置一分鐘，待乙醚上公升後，沿試管壁徐徐加入2滴吲哚試劑。在乙醚與培養物之間產生紅色環狀物為陽性。
2、 甲基紅試驗：培養48小時後，向乙隻葡萄糖蛋白腖水培養基內加入甲基紅試劑2滴，培養基變為紅色者為陽性，變為黃色者為陰性。（注意甲基紅不要假的太多，以免出現假陽性。）
3、 伏-普試驗：培養48小時後，向另外兩隻葡萄糖蛋白腖水培養基內加入5~10滴40%koh，然後加入等量的5%的α-萘酚試劑，用力**，再放入37℃恆溫箱中保溫15~30分鐘，以加快反應速度，若培養物呈現紅色則為陽性。
五、 實驗結果
（一） 澱粉水解試驗
（左上為枯草芽孢桿菌；左下為產氣桿菌；右上為大腸桿菌；右下為銅綠色假單胞菌）
（*因為金黃色葡萄球菌菌量剩餘少，所以實驗中菌餘用量大的產氣桿菌替代）
觀察結果如下觀察者：丁志康
（+表示陽性，即產胞外澱粉酶；+數量表示透明圈大小，+越多透明圈越大）
（二） 糖發酵試驗
實驗結果如圖所示：
左邊三支試管分別是乳糖發酵培養基
接種大腸桿菌、變形桿菌、空白對照。
右邊三支試管分別是葡萄糖發酵培養基
接種大腸桿菌、變形桿菌、空白對照。
觀察結果如下觀察者：丁志康
（+表示陽性，-表示陰性；第乙個格仔代表是否產酸，第二個格仔代表是否產氣）
（三） imvic試驗
（圖一圖二圖三）
1、圖一中左一為大腸桿菌，左二為產氣桿菌，左三為對照。
2、圖二中左一為產氣桿菌（淺橙色），右一為大腸桿菌（淡紫紅色），中間為對照（淺黃色）。
3、圖三中左為大腸桿菌，右為產氣桿菌。
觀察結果彙總如下觀察者：丁志康
（1）位置的優越性（+表示陽性，-表示陰性）
甲基紅試驗中產氣桿菌所在試管呈淡橙色，比對照組顏色略深，但遠比大腸桿菌淺，記作陰性。
4． www。google。com。cn。 大學生政策 2023年3月23日
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六、 思考題
(1) 你怎麼樣解釋澱粉酶是胞外酶而非胞內酶？
答：澱粉酶是大分子物質，無法通過跨膜運輸進入胞內，所以消化澱粉的酶應當是由細胞分泌進入外界環境中，在胞外對澱粉進行水解，之後細胞再將消化處理後的小分子物質運輸進胞內進行利用。
(2) 不利用碘液，你怎樣證明澱粉水解的存在？
答：澱粉是葡萄糖的多聚體，在被澱粉酶水解過程中極有可能水解產生葡萄糖，而葡萄糖又是還原性糖，故可以嘗試通過檢測還原性糖的方式（如斐林試劑）來驗證是否有澱粉酶存在。
(3) 假如某種微生物可以有氧代謝葡萄糖，發酵試驗應該出現什麼結果？
答：試管中培養基變為黃色，小玻璃管**現氣泡。
(4)討論imvic試驗在醫學檢驗上的意義。
答：imvic試驗可以非常快捷地鑑別出待測細菌的一些資訊，從而可以結合伯傑氏手冊對待測菌進行初步的鑑定，再結合革蘭氏染色有時甚至可以做到對待測菌進行定科或定屬的研究，這十分有利於細菌導致的傳染病的臨床**。此外，imvic試驗還可以快速地鑑別出大腸桿菌和產氣腸桿菌，這兩種菌廣泛存在於自然界，常被作為水源糞便汙染的標誌，所以imvic試驗也可廣泛應用於飲用水的檢測之中。
七、 附實驗中所用培養基配方
1、澱粉培養基
蛋白腖10g
nacl5g
牛肉膏5g
微生物鑑定中常用的生理生化反應
郭森 09級生命基地 200900140029 周二下午第五排 摘要 本次實驗包括大分子水解試驗 糖發酵試驗和imvic試驗 吲哚 甲基紅試驗 三類試驗，根據要求本實驗使用六種培養基分別對所需菌種組合進行了大約24h的培養，之後按照實驗要求進行各個試驗。最後基本上觀察到了實驗現象，了解了所用菌種鑑別...
微生物常規生化鑑定技術
一 形態結構和培養特性觀察 微生物的形態結構觀察主要是通過染色，在顯微鏡下對其形狀 大小 排列方式 細胞結構 包括細胞壁 細胞膜 細胞核 鞭毛 芽孢等 及染色特性進行觀察，直觀地了解細菌在形態結構上特性，根據不同微生物在形態結構上的不同達到區別 鑑定微生物的目的。細菌細胞在固體培養基表面形成的細胞群...
細菌鑑定中常用的生理生化反應
1 實驗原理 1 細菌生化試驗 各種細菌所具有的酶系統不盡相同，對營養基質的分解能力也不一樣，因而代謝產物或多或少地各有區別，可供鑑別細菌之用。用生化試驗的方法檢測細菌對各種基質的代謝作用及其代謝產物，從而鑑別細菌的種屬，稱之為細菌的生化反應。2 糖 醇 類發酵試驗 不同的細菌含有發酵不同糖 醇 的...