實驗一多酚氧化酶（ppo）的分離與提取
一、實驗目的
1、本實驗以馬鈴薯為主要的實驗材料，通過細胞組織破碎勻漿、過濾、離心、硫酸銨沉澱、透析等步驟獲得ppo的粗酶液。
2、通過本項實驗，學習和了解蛋白質的提取、分離的基本原理和方法，掌握相關儀器裝置的操作使用，以及蛋白質的提取、分離的系統技術。
二、實驗原理
多酚氧化酶是植物組織內廣泛存在的一種含銅氧化酶，位於質體、微體內，參與植物抗體的調節，屬於末端氧化酶的一種。在植物體受到機械損傷和病毒感染後，ppo催化酚與氧氧化成醌，使組織形成褐變，對ppo弄得的測定便是通過ppo氧化酚產生醌的變色反應測定其酶活性。
在蛋白質水溶液中，加入少量的中性鹽，如硫酸銨、氯化鈉等，會增加蛋白質分子表面的電荷，增強蛋白質分子與水分子的作用，從而使蛋白質在水溶液中的溶解度增大。這種現象稱為鹽溶；而在蛋白質水溶液中繼續加入無機鹽類可以其溶解度降低而析出的過程，該現象稱為鹽析。蛋白本身隨鹽濃度的溶解度變化曲線具有特徵性，可以依據此分離蛋白，硫酸銨分級便依據此原理，首先在蛋白質溶解度最高時，離心取上清，去除此時未溶解或已經沉澱的雜蛋白，之後再其溶解度最低且未變性的時候離心取沉澱復溶，去除尚未析出的雜蛋白，從而達到純化目的蛋白的目的。
多酚氧化酶在40%硫酸銨溶液中溶解度最高，而在75%硫酸銨溶液中沉澱量最高，由此可分離提取多酚氧化酶。但使用硫酸銨分級，分離後的產物中會有銨根離子殘留，如果採用凱氏定氮法測定蛋白質濃度時，殘留的銨根離子會造成測定時高於實際值，同時該樣品之後會用於離子交換層析純化，所以需要去除其中的離子，故需要透析去除其中銨根離子。
多酚氧化酶提取在ph6.0的中性偏酸條件下進行，在此ph值下，磷酸緩衝液的緩衝能力最強，故選擇使用其作為緩衝液，其中加入的edta為螯合劑，聚乙烯比咯烷酮是用於吸附醌，本身為固體顆粒，不需要溶解。
三、儀器與試劑：
（1）馬鈴薯200g
（2）試劑：
溶液a：0.03m磷酸緩衝液ph6.0（內含0.02m巰基乙醇，0.001medta，5%甘油，1%的聚乙烯比咯烷酮）
固體硫酸銨
溶液b：0.03m磷酸緩衝液ph6.0（內含0.02m巰基乙醇，0.001medta，0.005m 氯化鎂）
實驗器械與儀器裝置：
燒杯，玻璃棒，量筒，天平，高速冷凍離心機，離心杯，透析袋，植物組織勻漿器，過濾紗布。
四、實驗步驟：
1、將馬鈴薯切削塊，按照1g:1ml的比例加入0.03m磷酸緩衝液，放入植物組織勻漿器，將馬鈴薯充分粉碎使ppo從細胞中釋放出來。
2、將處理過的溶液用四層紗布過濾，去除溶液中的大顆粒固性物質，裝離心瓶配平後，12000轉離心10min。
3、離心後取上清液162ml，查表知慾得到0℃硫酸銨40%飽和度需要加入無水硫酸銨29.92g，稱量加入溶液中，用玻璃棒輕輕攪拌，避免因為機械剪下導致蛋白變性，0℃靜置一小時。
4、靜置一小時後，裝離心瓶，調平後離心機12000轉離心10min，棄沉澱得上清液192ml，查表知慾得0℃硫酸銨75%飽和度需要再加無水硫酸銨35.90g，稱量後加入，用玻璃棒輕輕攪拌，0℃靜置2小時沉澱。
5、將透析前樣品抽500ul作為粗酶樣品。
6、兩小時後，裝離心瓶，調平後12000轉離心10min，棄上清液，沉澱加10ml溶液b復溶，裝透析袋綁好透析過夜。
實驗二離子交換柱層析純化多酚氧化酶（ppo）及活性測定
一、實驗目的
1、本實驗擬通過離子交換層析分離純化ppo的操作，掌握該層析的基本原理、運用及操作技術。
2、通過純化ppo檢驗之前提取ppo的實驗是否成功。
3、通過本實驗學習並掌握傳統的蛋白質活性及濃度測定的方法、原理及相關儀器裝置的操作。
二、實驗原理
離子交換層析是依據各種離子或離子化合物與離子交換劑的結合力不同而進行分離純化的。離子交換層析的固定相是離子交換劑，它是由一類不溶於水的惰性高分子聚合物基質通過一定的化學反應共價結合上某種電荷基團形成的。 離子交換劑可以分為3部分；高分子聚合物基質、電荷基團和平衡離子。
電荷基團與高分子聚合物共價結合, 形成乙個帶電的可進行離子交換的基團。平衡離子是結合於電荷基團上的相反離子,它能與溶液中其他的離子基團發生可逆的交換反應。平衡離子帶正電的離子交換劑能與帶正電的離子基團發生交換作用, 稱為陽離子交換劑；平衡離子帶負電的離子交換劑與帶負電的離子基團發生交換作用,稱為陰離子交換劑。
離子交換反應可以表示為；
陽離子交換反應: ( r—x - ) y + + a + ( r—x - ) a + + y +
陰離子交換反應: ( r—x + ) y - + a - ( r—x + ) a - + y -
r代表離子交換劑的高分子聚合物基質, x - 和 x + 分別代表陽離子交換劑和陰離子交換劑中與高分子聚合物共價結合的電荷基團,y + 和y - 分別代表陽離子交換劑和陰離子交換劑的平衡離子, a + 和a - 分別代表溶液中的離子基團。
當a離子與離子交換劑的結合力強於y離子,或者提高a離子的濃度,或者通過改變其他一些條件,可以使a離子將y離子從離子交換劑上置換出來。也就是說,在一定條件下,溶液中的某種離子基團可以把平衡離子置換出來,並通過電荷基團結合到固定相上,而平衡離子則進入流動相,這就是離子交換層析的基本置換反應。通過在不同條件下的多次置換反應，就可以對溶液中不同的離子基團進行分離。
ppo是通過de52弱鹼性陰離子交換劑分離純化的，過程大體為：陰離子交換劑的電荷基團帶正電,裝柱平衡後,與緩衝溶液中的帶負電的平衡離子結合。待分離溶液中可能有正電基團、負電基團和中性基團。
加樣後,負電基團可以與平衡離子進行可逆的置換反應，而結合到離子交換劑上。而正電基團和中性基團則不能與離子交換劑結合,隨流動相流出而被去除。通過選擇合適的洗脫方式和洗脫液 ,如增加離子強度的梯度洗脫。
隨著洗脫液離子強度的增加，洗脫液中的離子可以逐步與結合在離子交換劑上的各種負電基團進行交換，而將各種負電基團置換出來,隨洗脫液流出。與離子交換劑結合力小的負電基團先被置換出來，而與離子交換劑結合力強的需要較高的離子強度才能被置換出來，這樣各種負電基團就會按其與離子交換劑結合力從小到大到順序逐步被洗脫下來，從而達到分離目的。
分離過程中的蛋白質濃度是通過考馬斯亮藍技術測定的，考馬斯亮藍法 ( bradford法)是根據蛋白質與染料相結合的原理設計的。考馬斯亮藍g-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合,使染料的最大吸收峰的位置(λmax)，由465nm變為595nm，溶液的顏色也由棕黑色變為藍色，該染料主要是與蛋白質中的鹼性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結合。在595nm下測定的吸光度值a5 95 n m，與蛋白質濃度成正比。
ppo催化各種酚與氧氣氧化為醌，以鄰苯二酚為底物，在0.2 m磷酸氫二鈉-0.1 m 檸檬酸緩衝液ph=8.
5的反應體系中，ppo催化鄰苯二酚形成褐色的醌，在分光光度計410 nm處使反應體系的od值發生變化，通過od值上公升的度數變化確定ppo的酶活力大小。
三、儀器與試劑：
試劑：0.02m tris-hcl 緩衝液ph7.4(內含0.001m edta)，考馬斯亮藍試劑，
檸檬酸緩衝液，鄰苯二酚，氯化鈉；聚乙二醇；deae-纖維素de52；
裝置：試管與試管架、燒杯、玻璃棒、滴管等、層析柱，ph試紙，恆流幫浦，梯度混合儀，核酸蛋白檢測儀，gl-20c高速冷凍離心機，酶標板、分光光度計、分析天平、容量瓶、移液管和試管等。
四、實驗步驟
（1）將經過透析的ppo蛋白粗酶溶液放入50ml離心管中12000轉4℃離心10min，取上清液備用，以此確保無固性物質，防止其破壞膠體。
（2）將層析柱洗淨，並確保在下出水口處沒有氣泡存留且可以正常出水，將已經配置好的柱材輕輕倒入層析柱中，勻速新增防止出現多個柱面，直到柱面到達8cm左右時停止。
（3）裝好的層析柱上端連線恆流幫浦，下端用一燒杯承液，恆流幫浦首先連線緩衝液，利用緩衝液將層析柱中的溶液置換出來，約5分鐘後開始用ph試紙檢測下出水口流出液體ph值，直到流出液ph與緩衝液ph相同時停止。
（4）將粗酶液上柱，用微量移液器緩慢加入，加樣過程中連續，保證液面在柱面上1cm處，防止液體低於柱材破碎，共上樣10ml。
（5）用含氯化鈉（0.2-0.6m）的0.02m tris-hcl緩衝液ph7.4（內含0.001m edta）進行梯度洗脫。
（6）每5ml乙個試管收集並進行編號，首先收集4管，編號1-4，為雜蛋白，之後收集16管樣品，編號5-20，為可能含有ppo的樣品。
（7）從1-20號樣品管中抽取20ul樣品分別加至酶標板中，加20ul考馬斯亮藍溶液，室溫下靜置2min，測其od595值並進行記錄，該資料說明其中粗蛋白含量。
（8）從1-20號樣品管中抽取20ul樣品分別加至酶標板中，加20ul檸檬酸緩衝溶液並加20ul鄰苯二酚於30℃環境中靜置2min，測其od410值並進行記錄，該資料說明其中多酚氧化酶的含量。
（9）對上一實驗中的粗酶提取物樣品重複第（7）（8）兩步，測其粗蛋白含量及比活力。
（10）0-100 μg/ml標準曲線的繪製：準確吸取0.5ml含20、40、60、80、100μg蛋白標準液，分別放入10ml的試管中，加5.
0ml考馬斯亮藍g-250蛋白試劑，將溶液混勻，2min後在分光光度計594nm處測定其吸光值，空白以去離子水或蒸餾水代替。吸光值為縱座標，蛋白含量為橫座標，繪製標準曲線。
（11）樣品中蛋白濃度的測定：要求待測樣品中的蛋白濃度範圍為1-1000μg/ml之間，若濃度過高，需要對其進行適當的稀釋，再用製作標準曲線的方法對樣品進行測定，測定的0.d595值結果由標準曲線求出樣品的蛋白濃度。
五、結果及分析
考馬斯亮藍od595
檸檬酸緩衝液od410
粗酶提取物比活力：od410=0.192
純化倍數=純化後比活力/粗酶比活力：0.201/0.192=1.047
結果分析：
圖1-1 多酚氧化酶（ppo）離子交換柱純化結果
多酚氧化酶（ppo）通過離子交換柱純化的結果如圖1-1，橫座標為洗脫體積，對應1-20號試管，共總洗脫體積為100ml。縱座標為od值，其中藍色od595z折線表示考馬斯亮藍測定時粗蛋白含量的變化，數值高低表示其中粗蛋白含量多少；紅色od410折線為檸檬酸緩衝液測定時多酚氧化酶含量的變化，數值高低表示其中酶比活力的高低。所有od值除0值外，均在0.
1-0.8之間，無異常值，無需稀釋後在測定。
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