正式報告
食品中蛋白質含量測定
（凱氏定氮法）
姓名： 白壹良
學號： 080800201
組別： 第17 組
同組人姓名： 周亞凱鍾晉
指導老師： 張雯
實驗日期： 2023年4月27日
繳交報告日期: 2023年5月4日
食品中蛋白質含量測定
【摘要】
氮元素是蛋白質區別於醣類，脂肪等的特徵，測出生物樣品中的含氮量即可求出蛋白質的含量。本實驗主要是通過凱氏定氮法測定牛奶中蛋白質的含氮量，並掌握凱氏定氮法的操作技術，包括樣品的消化處理、蒸餾、滴定及蛋白質含量計算。實驗時，樣品在凱氏燒瓶中經硫酸消化後 ，蛋白質分解，其中的氮與硫酸作用生成硫酸銨，再在強鹼條件下蒸餾出氨，用硼酸吸收， 以標準酸滴定，根據標準酸消耗的量，乘以一定係數，即可計算樣品中蛋白質的含量。
本實驗測出的蛋白質的含量為2.74g/100ml。
【實驗目的】
1、學習凱氏定氮法測定蛋白質的原理；
2、掌握凱氏定氮法的操作技術，包括樣品的消化處理、蒸餾、滴定及蛋白質含量計算。
3、學會使用凱氏定氮儀
【理論背景】
1、氮元素是蛋白質區別於醣類，脂肪等的特徵，而且絕大多數蛋白質的氮元素含量相當接近，一般恆定在15%—17%，平均值在16%左右，因此在蛋白質的定量分析中，每測得1克氮就相當於6.25g蛋白質。所以只要測出生物樣品中的含氮量，再乘以6.
25，就可以計算出樣品中的蛋白質含量。
2、利用硫酸及催化劑與食品試樣一同加熱消化，使蛋白質分解，其中c、h形成co2、h2o逸出，而氮以氨的形式與硫酸作用，形成硫酸銨留在酸液中。然後將消化液鹼化，蒸餾，使氨游離，用水蒸氣蒸出，被硼酸吸收。用標準鹽酸溶液滴定所生成的硼酸銨，從消耗的鹽酸標準液計算出總氮量，再折算為粗蛋白含量。
消化：2 nh2-(ch2)2 -cooh + 13h2so4 → (nh4)2 so4 + 6co2 + 12so2 + 16h2o
蒸餾：(nh4)2 so4 + 2naoh → 2nh3 + na2so4 + 2h2o
吸收：2nh3 + 4h3bo3 → (nh4)2 b4o7 + 5h2o
滴定：(nh4)2 b4o7 + 2hcl + 5h2o → 2nh4cl + 4h3bo3
反應量關係：n(n)=n(pr)=n(hcl)
【實驗裝置】
1、試劑
<1> 硫酸銅（cus·5o）
<2> 硫酸鉀
<3> 硫酸（密度為1.8419g/l）
<4> 硼酸濃液（20g/l）
<5> 氫氧化鈉溶液（400g/l）
<6> 0.01mol鹽酸標準滴定濃液
<7> 混合指示劑:0.1%甲基紅乙醇濃液1份,與0.1%溴甲酚綠乙醇濃液5份臨時
混合.<8> 牛奶樣品
2、儀器
微量定氮蒸餾裝置：如下圖所示
1、電爐；
2、水蒸氣發生器
3、螺旋夾a；
4、小漏斗及棒狀玻璃塞；
5、反應室；
6、反應室外層；
7、螺旋夾b；
8、冷凝管；
9、 蒸餾液接收瓶。
【實驗步驟】
樣品消化 → 蒸餾→ 吸收→ 滴定
【結果計算】
∴ 蛋白質%=（1.096-0）*0.0284*0.01401*6.28*100/10/100
=2.74%
式中： 蛋白質%—蛋白質的質量分數，%；
c—鹽酸標準溶液的濃度，mol/l；
v1—試劑滴定消耗標準液量平均值，ml；
v2—空白滴定消耗標準液量，ml；
m—樣品質量，g；
0.01401—氮的毫摩爾質量，g/mmol；
f—蛋白質係數。
一般食物為6.25；乳製品為6.38；麵粉為5.70；高粱為6.24；
花生為5.46；公尺為5.95；大豆及其製品為5.71；肉與肉製品為6.25；
大麥、小公尺、燕麥、裸麥為5.83；芝麻、向日葵5.30。
【注意事項】
1、凱氏定氮法測蛋白質含量是依據氮元素與蛋白質的對應關係，從而通過測定氮元素的含量而測定蛋白質的含量，故使用此法須注意以下幾點：
a、應首先確定樣品中無其他含氮化合物，以免使計算結果偏大；
b、盡量確保消化和吸收的充分，以免氮的流失，致使結果偏小；
c、吸收式防倒吸，以免導致實驗失敗和機器損壞。
2、消化時注意問題：
①加入樣品不要沾附在凱氏燒瓶瓶頸；
②消化開始時不要用強火，要控制好熱源，並注意不時轉動凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘渣洗下並促進其消化完全；
③樣品中若含脂肪或糖較多，在消化前應加入少量辛醇或液體石蠟或矽油作消泡劑，以防消化過程中產生大量泡沫；
④消化完全後要冷至室溫才能稀釋或定容。所用試劑溶液應用無氨蒸餾水配製。
3、 蒸餾、吸收注意問題：
（1）整套裝置不能漏氣，要注意各蒸汽控制夾子的操作，以防蒸汽受阻**或吸收液倒吸。
（2）在蒸汽發生瓶中要加入硫酸和甲基橙使呈酸性以防氨蒸出。
（3）加鹼量要足，應使消化液呈深藍色或產生黑色沉澱。操作要迅速，漏斗要採用水封防氨逸出。
（4）冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸餾；吸收液溫度不應超過40℃，若超過時可置於冷水浴中使用；蒸餾完畢後，應先將冷凝管下端提離液面，再蒸1分鐘，將附著在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶內，再將吸收瓶移開，最後關閉電源，絕不能先關閉電源，否則吸收液將發生倒吸。
（5） 在每次測定前及兩次測定之間，均要洗滌反應管(倒吸法，在吸收瓶中加入蒸餾水，其餘同測定時的做法，在蒸汽發生器中水劇烈沸騰後，立即移開電爐，水即從吸收瓶中倒吸入反應管，再倒吸入汽水分離管或蒸汽發生器中，開啟夾子，即可放出廢水。
（6）混合指示劑在鹼性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色
4、本法適用於固體、半固體試樣以及液體樣品檢測。半固體試樣一般取樣範圍為2.00g~5.
00g；液體樣品取樣10.0ml~25.0ml（約相當氮30mg~40mg）。
若檢測液體樣品，結果以g/100ml表示。
【討論】
(1)、演算法：
凱氏定氮元素是蛋白質區別於醣類，脂肪等的特徵，而且絕大多數蛋白質的氮元素含量相當接近，一般恆定在15%—17%，平均值在16%左右，因此在蛋白質的定量分析中，每測得1克氮就相當於6.25g蛋白質。所以只要測出生物樣品中的含氮量，在乘以6.
28，就可以計算出樣品中的蛋白質含量。
反應量關係：n(n)=n(pr)=n(hcl)
(2)、誤差分析：
①樣品中可能含有其他含氮物質使結果偏大
②提採樣品溶液時，由於操作不規範，出現溶液提取值偏差
③牛奶的消化不完全，蛋白質分解不充分，氨沒有很好的和濃硫酸結合，
造成氮的流失，導致實驗值偏小；
④在定容過程中，有部分消化液殘留在玻棒和凱氏定氮瓶中
⑤試劑用量沒把握好，導致反應進行得不徹底
⑥ 滴定時，操作不規範，讀數讀得不夠準確；
對顏色的誤差也不可避免，導致滴定終點的判定也會有一定的誤差
（3）、粗蛋白：用凱氏定氮法通過測總氮量來確定蛋白質含量，包含了核酸、生物鹼、含氮類脂、卟啉、以及含氮色素等非氮蛋白質含氮化合物，所以這樣的測定結果稱為粗蛋白。
（4）思考題
1、 預習凱氏定氮法測定蛋白質的原理及操作。
答：（1）氮元素是蛋白質區別於醣類，脂肪等的特徵，而且絕大多數蛋白質的氮元素含量相當接近，一般恆定在15%—17%，平均值在16%左右，因此在蛋白質的定量分析中，每測得1克氮就相當於6.28g蛋白質。
所以只要測出生物樣品中的含氮量，再乘以6.28，就可以計算出樣品中的蛋白質含量。
（2）利用硫酸及催化劑與食品試樣一同加熱消化，使蛋白質分解，其中c、h形成co2、h2o逸出，而氮以氨的形式與硫酸作用，形成硫酸銨留在酸液中。然後將消化液鹼化，蒸餾，使氨游離，用水蒸氣蒸出，被硼酸吸收。用標準鹽酸溶液滴定所生成的硼酸銨，從消耗的鹽酸標準液計算出總氮量，再折算為粗蛋白含量。
消化：2 nh2-(ch2)2 -cooh + 13h2so4 → (nh4)2 so4 + 6co2 + 12so2 + 16h2o
蒸餾：(nh4)2 so4 + 2naoh → 2nh3 + na2so4 + 2h2o
吸收：2nh3 + 4h3bo3 → (nh4)2 b4o7 + 5h2o
滴定：(nh4)2 b4o7 + 2hcl + 5h2o → 2nh4cl + 4h3bo3
反應量關係：n(n)=n(pr)=n(hcl)
2.蒸餾時為什麼要加入氫氧化鈉溶液？加入量對測定結果有何影響？
答：鹼蒸餾使氨游離，再用hcl標準溶液就可測出含氨量，最後得到蛋白質的量，加入氫氧化鈉可以加速反應。
3.實驗操作過程中，影響測定準確性的因素有哪些？
答：硼酸溫度、試劑的用量、ph、溶液濃度、人為誤差。
(5)、預習時存在的問題：
加入硫酸銅，硫酸鉀，濃硫酸的作用分別是什麼？
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