蛋白質濃度測定——微量凱氏定氮法
一目的：
學習蛋白質微量凱氏定氮法的原理及操作技術。
二原理：
天然有機物(蛋白質等)的含氮總量，通常用微量凱氏定氮法來測定。該法是利用一般蛋白質含氮量平均在16％，將測得的含氮量折算成樣品中的蛋白質含量。
樣品在凱氏燒瓶中經硫酸消化後，蛋白質分解產生氨，氨與硫酸作用生成硫酸銨，分解反應進行很慢，需加入催化劑(hgo)，加k2s04以提高溶液的沸點，加入h202可加速反應。消化完後，在凱氏定氮儀中，加入強鹼鹼化消化液使硫酸銨分解，放出氨。用水蒸汽蒸餾法將氨收集於過量的硼酸溶液中，以標準酸滴定，根據標準酸消耗的量，乘以一定係數，即可計算樣品中蛋白質的氮含量。
若以甘氨酸為例，其反應式如下：
三器材50ml凱氏燒瓶，50ml錐形瓶，1～2ml移液管，10ml量筒，表面皿，10ml酸式滴定管，滴定臺，漏斗架，萬用電爐，微量凱氏定氮儀，電熱套。
四試劑及樣品
(1) 40% naoh - 5% na2s2o3溶液;
(2) 混合指示劑：0.04%甲基紅-60% 乙醇指示劑溶液;
(3) 2%硼酸溶液;
(4) 0.01n鹽酸標準溶液；
(5) 醬油（20ul）、維他奶(100ul)樣品。
(6) 標準硫酸銨溶液（0.3mg/ml 氮）
五操作方法
(1) 消化：取醬油（20ul）、維他奶(100ul)，分別放入50ml凱氏燒瓶中，加入粉狀硫酸鉀約2.25g，黃色hgo 20mg，硫酸1.
5ml，搖動燒瓶，使全部樣品浸沒於硫酸內，將燒瓶置於電爐上，在通風櫥內加熱至量樣品中有機物全部破壞，停止加熱，放冷，加2滴h202，繼續消化10min（顏色由黑變透明）。同時消化1份空白燒瓶。
(2) 溶解消化液：冷後(約10分鐘)，向每個盛有消化液的凱氏燒瓶加蒸餾水10ml，加熱溶解，備用。
(3) 蒸餾和滴定
安裝好凱氏定氮裝置，在水蒸汽發生器內裝入蒸餾水至 2／3體積處，加入硫酸lml，甲基紅指示劑2~3滴，少許沸石，毛細管數支，接通電熱套的電源，加熱，用產生的水蒸氣沖洗全套儀器，至餾出液不顯酸鹼性。
從進樣杯中分別加入lml標準(nh4)2so4溶液、樣品液、空白液，用少量蒸餾水洗3次凱氏燒瓶，塞好小玻塞。
量取2％硼酸-混合指示劑溶液10ml於錐形瓶(接收瓶)中，置於冷凝管下端，不要留下空隙。
注入10ml 40％na0h~5% na2s2o3鹼液到進樣杯中，小心提起玻塞，慢慢放入鹼液，當鹼液流剩少許時，塞下小玻塞(防止nh3 逸出)，此時鹼液與消化液呈黑色。10ml水分3次注入進樣杯，操作同上，目的是盡量把鹼液衝下去。立即塞緊棒狀玻塞，並加入少量蒸餾水，水封進樣杯口，以防漏氣。
關閉排液管，開始蒸餾，讓其反應至指示劑在5分鐘內變色，自變色起蒸餾5分鐘，溶液從粉色→綠色，到時間後，冷凝管下端移離指示劑液面，繼續蒸餾1分鐘，用蒸餾水沖洗冷凝管下端出口，錐瓶口以表面皿覆蓋待滴定。用標準鹽酸滴定至終點（淡粉色)。
本實驗成功的關鍵：
a．清洗乾淨反應室；
b．加樣時放鬆排液夾；
c．加鹼時保持密閉狀態；
d．用硼酸指示劑接收氨，下口全泡入液中；
e．蒸餾時夾緊排液夾。
f. 滴定準確。
注意事項：
(1)在整個測定過程中，應該避免周圍環境裡氨的影響，以確保結果的穩定。
(2)若消化液未冷卻便加水，可使硫酸爆沸或消化瓶爆裂，很危險!若水不純，含oh-，可使無色透明之消化液變色，黃褐或黑色。
六. 計算
1）標準硫酸銨氮含量的計算：
標a為滴定樣品用去的鹽酸平均ml數；nhcl 為鹽酸的質量濃度等於0.0100mol/l; 14為氮的原子量(1ml 鹽酸相當於0.14mg氮)；
2）樣品氮及蛋白質的質量濃度的計算：
樣品氮的質量濃度的計算：
式樣品中：a為滴定樣品用去的鹽酸平均ml數；b為滴定空白用去的鹽酸平均m1數；0.0100為鹽酸的濃度(mol／l); n為樣品的稀釋倍數。
14為氮的原子量(鹽酸相當於0.14mg氮)；v為樣品ml數。
蛋白質的質量濃度的計算:
樣品中蛋白質含量（mg/ml）=蛋白氮×n
n為不同樣品的蛋白質換算係數，一般均按蛋白質含氮量16％計算，即100／16=6．25，需要比較準確的計算時，應採用不同的換算係數。如
七．思考題：
1.測定標準硫酸銨和空白的目的分別是什麼？
2.小結本人實驗中的經驗教訓。
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