2013.3
附錄培養基母液的配製（實驗老師準備）
一、實驗目的：掌握培養基母液配製的方法。
二、實驗原理：配製培養基時，為了使用方便和用量準確，通常採用母液法進行配製，即將所選培養基配方中各試劑的用量，擴大若干倍後再準確稱量，分別先配製成一系列的母液置於冰箱中儲存，使用時按比例吸取母液進行稀釋配製即可。以ms培養基為例，所需配製的母液可分為：
ms大量元素母液、ms微量元素母液、ms鐵鹽母液和ms有機化合物母液等。另外，還要配製生長物質母液，在不同型別的培養基中使用。
三、實驗器具與藥品：
電子分析天平、托盤天平、燒杯（50ml, 100ml, 500ml, 1000ml）、量筒（1000ml,100ml, 25ml）、容量瓶（1000ml,500ml,100ml）、藥勺、稱量紙、玻璃棒、滴管、電爐、冰箱。
配製ms培養基所需藥品按培養基的配方準備。植物生長調節物質，2,4-d, naa, 6-ba等。
四、培養基母液的配製過程
首先，按下錶「ms培養基母液的配製」，將各種母液根據各自的擴大倍數，計算出擴大後的稱取量，然後，分別進行藥品稱取和母液配製。
（1） ms大量元素母液的配製
按照ms培養基配方的用量擴大20倍，將大量元素配製成20倍的母液。配製時先用量筒量取蒸餾水800ml，放入1000ml的燒杯中，依次分別稱取kno3 38g;
nh4no3 33g, mgso4·7h2o 7.4g, kh2po4 3.4g, cacl2·2h2o 8.
8g，按順序先後倒入燒杯中，用玻璃棒攪動，待第一種化合物溶解後再加入第二種化合物，當最後一種化合物完全溶解後，將溶液倒入1000ml的容量瓶，用蒸餾水定容至1000ml,然後，倒入細口磨砂試劑瓶中，貼上標籤，註明配製日期、擴大倍數、配製人姓名、置於4℃冰箱儲存備用。配製培養基時每公升ms培養基吸取該母液量為50ml。
（2） ms微量元素母液的配製
將ms培養基配方中微量元素的無機鹽用量分別擴大1000倍，用電子天平分別依次稱取mnso4·4h2o 22.3g， znso4·7h2o 8.6g , h3bo3 6.
2g，ki 0.83g，na2moo4·2h2o 0.25g，cuso4·5h2o 0.
025g，cocl2·6h2o 0.025g，並用重蒸水逐個溶解，待全部溶解用容量瓶定容後，裝入1000ml倒入細口磨砂試劑瓶中，貼上標籤，註明配製日期、擴大倍數、配製人姓名、置於4℃冰箱儲存備用。配製培養基時每公升ms培養基吸取該母液量為1ml。
( 3 ) 鐵鹽母液的配製
在電子天平上準確稱量2.78g硫酸亞鐵(feso4·7h2o)和3.73g乙二胺四乙酸鈉(na-edta),分別倒入盛有400ml蒸餾水的燒杯中，微加熱並不斷攪拌使之全部溶解。
將兩種溶液倒入同乙個1000ml的容量瓶中，混合均勻後，用蒸餾水定容至1000ml，並倒入棕色磨口試劑瓶中，經室溫放置一段時間令其充分反應後，貼上標籤，註明配製日期、擴大倍數、配製人姓名、置於4℃冰箱儲存備用。如果將新配製的鐵鹽母液立即放入冰箱中。則會容易形成沉澱。
配製培養基時，每配製1000mlms培養基吸取此母液10ml。
( 4 )ms有機母液的配製
用電子天平依次稱取：肌醇（環己六醇）5000mg，鹽酸硫胺素（維生素b1）5mg，菸酸25mg，甘氨酸100mg，鹽酸吡哆醇（維生素b6）25mg，用蒸餾水依次溶解並定容後，裝入500ml的磨口瓶中，貼上標籤，註明配製日期、擴大倍數、配製人姓名，置於4℃冰箱儲存備用。配製培養基時，每配製1lms培養基吸取該母液10ml。
（5）植物生長物質母液的配製
⑴ 2,4-d母液：準確稱量2,4-d 50mg，先用1~3ml90%乙醇完全溶解後，加蒸餾水定容；也可以用少量鹼（如1mol/氫氧化鉀、氫氧化鈉）溶液，使之中和成為鈉鹽或鉀鹽，在水中溶解，再加水定容至100ml，即配成濃度為500ml/l的母液。貼上標籤，註明名稱、濃度和配製日期，放入4℃冰箱儲存。
naa母液的配製過程與2,4-d相同。
⑵6-ba母液：準確稱量50mg 6-ba，加入少量鹼溶液（如1mol/氫氧化鉀、氫氧化鈉）或稀鹼液（1mol/l鹽酸）溶液使之完全溶解後，加蒸餾水定容至100ml，即配製成濃度為500mg/l的6-ba的母液。轉入磨口試劑瓶中，並貼上標籤，註明母液名稱、濃度和配製日期，放入4℃冰箱儲存備用。
五、注意事項
在配製大量元素母液時，混合、溶解各種無機鹽時要注意先後順序，盡量把ca2+，so42-,po43- 等離子錯開分別溶解，同時稀釋濃度要大些，並要慢慢地邊混合邊攪拌。
實驗一 ms培養基的配製與滅菌
一、實驗目的：學習用母液法配製ms培養基以及掌握培養基滅菌的方法及操作過程。
二、實驗原理：組織培養所用的培養基含有植物細胞生長所必需的各類營養物質，同時也是各種細菌、真菌滋生繁殖的極好場所。因此必須對培養基進行滅菌處理，一確保無菌操作的順利進行。
三、實驗器材及試劑：
①器材：電子天平、托盤天平、燒杯（50ml, 100ml, 500ml, 1000ml）、量筒（1000ml,100ml, 25ml）藥勺、稱量紙、玻璃棒、移液管（10ml, 5ml, 2ml, 1ml,0.5ml,0.
2ml）、電爐（1000w）、石棉網、吸耳球、酸度計或ph試紙（5.0~7.0）、三角瓶（50ml,100ml）或果醬瓶、耐高溫高壓的專用封口膜、線繩、冰箱、手提式消毒滅菌鍋或臥式電壓力滅菌鍋
②試劑：蔗糖、瓊脂、活性炭、1m hcl、1m naoh；2,4-d、6ba等植物激素母液及ms基本培養基母液。
四、實驗步驟
（1）培養基的配方
本次實驗分成三組，每組配製一種培養基，各組所配製的培養基如下：
a 胡蘿蔔塊根愈傷組織誘導培養基：
ms+2,4-d（1mg/l）+蔗糖（30g/l）+瓊脂（8g/l） ph6.0
配製1-1.5l用小果醬瓶分裝30-35瓶，另：需要無菌水每人兩瓶（大果醬瓶）、紗布5塊、碟子每人乙個（30-35個），用報紙包好一同滅菌。
b 香蕉芽的繼代生芽培養基：
ms+6ba（5mg/l）+iba（0.1mg/l）+蔗糖（30g/l）+瓊脂（8g/l） ph6.0
配製2-2.5l用小果醬瓶分裝60-65瓶，即每人兩瓶，另：需要紗布5塊、碟子每人乙個（30-35個），用報紙包好一同滅菌。
c 香蕉芽苗的生根培養基：
1/2ms+蔗糖（30g/l）+瓊脂（8g/l）+活性炭（1g/l）ph6.0
配製1.5l用大果醬瓶分裝30-35瓶，另外：紗布5塊，碟子每人乙個（30-35個），用報紙包好一同滅菌。
（2）培養基的配製
1 稱取母液：首先，將所需的各貯存母液按順序放好，將潔淨的各種玻璃器皿，量筒、燒杯、移液管、玻璃棒等放在相應的位置。然後，根據所需配製的培養基用量，按照下面的公式及所需的各種母液的擴大倍數，分別計算需吸取各母液的數量（ml）。
吸取量=需要配製培養基的體積×需要配製濃度/母液濃度
2 培養基定容：取1l大燒杯乙隻，用量筒或移液管分別吸取各母液（注：各母液移液管不能混用）。倒入500ml蒸餾水，然後準確稱量瓊脂及蔗糖，最後定容至1l。
3 調節ph值：用1mol/lhcl或1mol/lnaoh將培養基ph值調節至5.8~6.
0。用酸鹼調節ph值時，應用玻璃棒不斷攪拌後，再用ph試紙或ph計測試培養基的ph值。然後放在電爐或微波爐內煮沸，待瓊脂完全溶化。
4 分裝：將培養基分裝入相應的果醬瓶中，每瓶大約20~30ml，蓋上蓋子，貼上標籤。用記號筆註明培養基名稱、配製時間及配製者姓名，待滅菌用。
5 培養基的滅菌：把分裝好的培養基及其他需滅菌的各種器具和蒸餾水等，放入滅菌鍋的消毒桶中，放入鍋中。
（3） 培養基的滅菌步驟：
利用臥式高壓滅菌鍋的滅菌步驟，整個過程大概需要2個小時，按以下步驟操作：
①設定壓力為0.11mpa，溫度為121℃
②三開（開出氣閥、進水閥、外紅閥）
③注水（開水龍頭）至離進水顯示柱高階1cm左右
④三關（關出氣閥、進水閥、外紅閥）
⑤開啟電源開關，通電
⑥夾層壓力在0.1mpa以下可以將培養基和無菌水等需要滅菌的物品放入滅菌室⑦夾層壓力達到0.1mpa時開啟夾層與滅菌室的開關
⑧夾層與滅菌室同事公升溫公升壓，如停止不公升溫可以手動開啟放氣閥再放氣3~5分鐘，待冷空氣全部排淨就可以公升溫公升壓，待達到0.1mpa、121℃時，滅菌鍋會自動保溫不會繼續公升溫與公升壓，這時開始計時15~20分鐘，（培養基滅菌需要15~20分鐘、無菌水需要20~30分鐘）
⑨時間到，關閉電源，可以慢慢開啟出氣閥放氣
⑩待溫度與壓力下降，80℃以下時可以將培養基與無菌水等移出滅菌鍋備用
五實驗結果：一周後觀察試驗結果，描述培養基是否凝固及狀態、顏色，如果實驗失敗（培養基不凝固）請分析原因，並自己找時間重新配置。
六思考題：
1.培養基配置過程中應注意哪些因素？培養基為什麼要煮沸後再分裝？
2.調節ph值應該調高0.2-0.3個單位，為什麼？
3.什麼因素影響培養基的凝固？滅菌鍋的應用應該注意哪些方面？
實驗二外植體的消毒及其愈傷組織的誘導
一、實驗目的：通過實驗，初步掌握外植體材料的消毒、接種的無菌操作技術以及外植體愈傷組織的誘導方法。
二、實驗原理：植物組織培養是應用無菌操作的方法培養離體植物器官或組織、甚至單個細胞的過程，如果組織培養使用的植物材料是帶菌的，在接種前就必須選擇合適的消毒劑對植物外植體進行表面消毒，獲得無菌材料去進行組織培養，這是取得組織培養成功的最基本的前提和保證。由於植物細胞具有全能性，外植體在合適的培養基上，通過脫分化，形成一種能迅速增值的無特定結構和功能的細胞團—愈傷組織，而植物生長調節劑2,4-d是誘導外植體形成愈傷組織的重要影響因素，本實驗採用ms培養基新增2,4-d來誘導胡蘿蔔的愈傷組織。
植物組織培養實驗指導
2014.3 附錄培養基母液的配製 實驗老師準備 一 實驗目的 掌握培養基母液配製的方法。二 實驗原理 配製培養基時，為了使用方便和用量準確，通常採用母液法進行配製，即將所選培養基配方中各試劑的用量，擴大若干倍後再準確稱量，分別先配製成一系列的母液置於冰箱中儲存，使用時按比例吸取母液進行稀釋配製即可...
植物組織培養實驗指導書
植物組織培養實驗指導 的相關說明 一 本指導用於 植物組織培養概論 課程的實驗教學。二 各專業班級根據實際情況做相應調整，調整情況詳見各專業班級的授課計畫。其中15個課時的內容調整如下 實驗一 二 五3學時 實驗六3學時 實驗七3學時 實驗九 實驗十二3學時 實驗十三3學時 實驗一實驗室基本裝置及其...
植物組織培養實驗報告
實驗一母液的配置與儲存 一 實驗目的 通過配置ms培養基母液，掌握母液的配置和儲存方法 二 實驗原理 配置培養基時，為了使用方便和用量準確，通常採用母液法進行配置，即按培養基配方中各試劑的用量，擴大若干倍後再準確稱量分別先配製成一系列的母液置於冰箱中儲存，使用時按比例吸取母液進行稀釋配置即可。三 實...