《植物組織培養實驗指導》的相關說明
一、本指導用於《植物組織培養概論》課程的實驗教學。
二、各專業班級根據實際情況做相應調整，調整情況詳見各專業班級的授課計畫。其中15個課時的內容調整如下：
實驗一、
二、五3學時
實驗六3學時
實驗七3學時
實驗九、實驗十二3學時
實驗十三3學時
實驗一實驗室基本裝置及其用途的識別
一、 目的
認識植物組織培養實驗室的基本結構，必須的基本裝置及其用途與作用方法。
二、 實驗室的基本結構
（一） 化學實驗室（工作室）培養基藥品稱量、配製、分裝、滅菌；材料預處理；培養材料的觀察分析；制蒸餾水。
裝置、藥櫃、工作台、蒸餾水器、天平、冰箱，手提高壓消毒鍋、顯微鏡、解剖鏡、各種玻璃儀器、金屬儀器等。
安裝水、電、排氣等裝置。
（二） 接種室
無菌操作室
接種箱超淨工作台
（三） 培養室
（四） 洗滌、消毒室；臥式高壓消毒鍋。
（五） 溫室（培養大棚）。
實驗二常用儀器、必要器皿、幾種主要裝置的使用方法、
常用幾種藥劑的配製
一、 目的
認識植物組織培養必需的儀器、器皿，幾種主要裝置的使用方法、常用幾種藥劑的配製。
二、 常用儀器
1. 蒸餾水器（學習操作）
2. 手提式高壓消毒鍋、臥式高壓消毒鍋（學習使用、操作）
3. 天平
藥物天平（工業天平）、粗天平、（精密度1/10）
扭力天平（精密度1/100）
分析天平（精密度1/10000）
4. 超淨工作台（學習、使用、操作）
5. 電熱乾燥箱（烘箱）
6. 恆溫光照培養箱（學習、操作）
7. 電冰箱
8. 顯微鏡和解剖鏡
1 手提式解剖鏡（學習、使用、操作）
2 立體解剖鏡
3 普通顯微鏡
9. 旋轉培養機
10. 離心機（學習、使用、操作）
11. 酸度測定儀：⑴ 精密ph4－7試紙；⑵ 筆型袖珍酸度計。
三、 必要的器皿
（一）玻璃器皿
1. 培養器皿
1 試管
2 三角燒瓶（錐形瓶）
3 圓形高形培養瓶（罐頭瓶）
4 培養皿
5 扁身培養瓶
6 l型和t型管
7 凹面載玻片
2. 盛裝器皿
1 試劑瓶
2 燒杯
3. 計量器皿
1 量筒
2 容量瓶
3 吸管
4. 其它器皿
滴瓶、稱量瓶、漏斗、玻璃管、注射器等實驗室常用器皿。
（二）金屬器械
1. 鑷子類
1 20－25cm長型鑷子（接種或轉移愈傷組織）
2 尖端彎曲「槍型」鑷子（鑷取較小的植物組織）
3 尖頭鐘錶鑷子和鴨嘴鑷子（剝離表皮用）
4 尖端為小鏟狀鑷子（挖取帶瓊脂培養基的培養物）
2. 解剖刀和刀類
1 眼科用刀種牛痘疫苗的菱形刀（切割柔軟組織中小細胞團）
2 解剖刀（手術刀）
3 雙面刀片焊接在玻棒上（切取莖尖用）
4 鋒利小刀、大刀和小鐵鍬
3. 剪刀類
① 解剖剪 ② 眉剪 ③ 眼科剪 ④ 18－25cm彎頭剪 ⑤ 俢枝剪
4.接種針
四、幾種常用藥劑的配製
（一） 用95%嘗試酒精配比不同濃度的酒精的配製。
學習配製70%和75%酒精。
（二） 消毒劑
1. 20%次氯酸鈉溶液稱取20g次氯酸鈉用少許水溶解，100ml水定容。
2. 0.1%公升汞（hgcl2）溶液稱取0.1g hgcl2少許水溶解，100ml水定容。
（三） 洗滌劑
1. 2hcl酒精 95%酒精100ml加入2mlhcl
2. 硫酸－重鉻酸鉀洗液
稱取10g重鉻酸鉀加入蒸餾水90ml，加熱溶解冷卻後，逐漸加入濃硫酸175ml，放入棕色玻璃瓶備用，（注意：切記不可將盛過灑精，甲醛等原劑的藥品玻璃器皿直接泡入洗液在，因為重鉻酸鉀是一種強的氧化劑，一旦被還原氧化，洗液變綠，失去洗滌作用）。這些器皿必須用自來水沖洗乾淨並晾乾再浸入洗液。
（四） 1摩爾濃度(mg/l )naoh 和1摩爾濃度（mg/l）hcl配製。
摩爾濃度是指用1公升（1000ml）溶液中所含溶質的分子量數來表示的溶液的濃度。用m表示。
1. naoh摩爾濃度（m）
naoh摩爾質量=分子克數=40g
1m naoh是指1000ml溶液中含有40克摩爾質量的naoh，現要配製100ml
40×0.1＝4g
稱取naoh4g，用少量溶解，定容100ml.
2. hcl的摩爾濃度
具體配製酸的mol濃度時，應考慮原濃酸的比重mol濃度。
要求配製的mol濃度×需配製的體積×原酸分子量
v 原酸的百分濃度×原酸的比重×1000
配製1.0m hcl 100ml，量取38%，比重為1.19的hcl8.06ml加蒸餾水，定容至100ml。
實驗三洗滌――滅菌
植物組織培養能否成功重要的一環是在無菌條件下進行操作與培養，導致汙染的**主要有：⑴ 器皿和用具；⑵ 培養基；⑶ 培養材料；⑷ 工作人員本身；⑸ 操作時的空氣。防止汙染的有效方法是將所有與培養有關的器皿，用具、培養基、接種室、培養室等進行滅菌和無菌操作。
一、洗滌
（一）玻璃器皿的洗滌
1. 新購置的玻璃器皿的洗滌（學習、操作）
因有游離鹼性物質，使用前先用1%稀鹽酸浸泡一夜，然後用肥皂水洗淨，清水沖洗，最後用蒸餾水沖洗一次，幹後備用。
2. 已用過玻璃器皿
先將殘渣除去；用清水洗淨，再用熱肥皂水或洗衣粉洗淨，清水沖洗乾淨，最後用蒸餾水沖洗一次，幹後備用。
3. 對一些不宜刷洗的玻璃器皿如：吸管，滴管及較髒的器皿等先用去汙粉和去油劑刷洗，自來水衝乾淨後，晾乾，再浸入硫酸－重鉻酸鉀洗液中浸泡若干小時，用夾子取出在自來水沖洗乾淨，再用蒸餾水沖洗1－3遍，稍晾不滴水後置於乾燥箱內烘乾備用。
4. 對帶有凡士林，石蠟，或膠布的器皿選用特殊方法處理後，再用常規方法洗滌。帶有凡士林的器皿須先用廢紙把凡士林擦去，再用汽油擦洗乾淨，然後用熱肥皂水煮沸半小時，刷洗後，自來水衝乾淨。
若帶有石蠟，可在玻璃器皿下墊幾層廢紙，放入60－70℃溫箱中1加熱－2小時，待石蠟融化後，再用廢紙反覆擦2－3次即去石蠟再泡入洗衣粉的熱水中洗乾淨最後用自來水沖洗，蒸餾水沖洗乾淨若有膠布粘著物，先用70%酒精棉球擦數遍，溶解粘膠物，並用少許去汙粉刷抺，再用洗衣粉煮沸半小時，刷洗乾淨，自來水沖洗，晾乾，再泡入洗液。
(二)金屬器皿
新購置金屬器皿因其上有潤滑油或防繡油，用蘸有四氯化碳（ccl4 ）布擦去油脂，再用濕布擦淨，乾燥備用。
二、滅菌
（一）器皿和用具常用滅菌方法：
1. 熱壓滅菌法（學習操作）
將洗淨的培養器皿，用具，用牛皮紙包好，放入高壓消毒鍋中，1.1壓力下滅菌20－30分鐘。
2. 乾熱滅菌法
洗淨的玻璃器皿置於電熱乾燥箱中，150℃40分鐘或120℃兩小時，待冷卻後使用。
（二）無菌室滅菌（接種室、培養室）
1. 用新潔爾滅擦抺工作台，70%酒精擦拭超淨工作台。
2. 薰蒸（學習操作）
用甲醛、高錳酸鉀提前1－3天薰蒸密封房間方法1：甲醛倒入蒸發皿加熱，用量10ml/m2。
方法2：甲醛（hcho）與高錳酸鉀（kmn4）以10：1比例混合。
3. 接種前用70－75%酒精噴霧，使飄在空氣中的塵埃沉積下來。
4. 用紫外光燈進行照射滅菌（波長2650－2660a最好）接種箱及用具30－40分鐘。
（三）培養基滅菌（略）
（四）培養材料滅菌（略）
（五） 工作人員無菌操作（略）
實驗四培養基（一）培養基成分介紹
一、培養基的成分是影響組織培養的最根本的外部因素。
對某種植物培養成功與否是各種條件綜合影響的結果。這些綜合因素存在於每乙個培養步驟。每乙個單因子都可能導致培養的失敗。
影響培養效果的因素分有外因和內因，外因有培養基成分及物理狀態，培養溫度，光照強度，光的質及波長等等。這五種最根本的是培養基成分，因為它是培養材料的生命之地，它若適宜。培養則易成功，反之則失敗。
二、培養基的成分
（一）大量元素
植物生長必須的c、h、o、n、p、 k、s、ca、mg九種元素在植物組成中含量較多，通常佔乾重或灰分的千分之幾，百分之幾，所以在培養基中用量較大叫大量元素，大量元素h、o兩種元素主要從水中獲得，c從光合作用co2來，但離體植物或組織沒有光合作用能力。因此通過加糖提供c源，常用濃度為1－5%，常用分析純、化學純的蔗糖。n常用硝態n（硝酸鉀等）和銨態n（硫酸銨等）大多數以硝態n為主。
ms培養基和n6培養基既含有硝態n又含有銨態n，p參與植物生命過程中的核酸合成，蛋白質合成，光合作用，呼吸作用及能量貯存，轉化和釋放等重要生理生化過程。
k在近代培養基中，用量有提高的趨勢，ca、mg、s的需要則較少。能提供這些元素的物質主要有磷酸二氫鉀（kh2po4），七個結晶水的硫酸鎂（mgso4.7h2o），二個結晶水的氯化鈣（cacl2.
2h2o）。
（二）微量元素
包括fe 、cu、mo（鉬）、zn、na、mn、co（鈷）、b（硼）和i（碘），它們在植物組織培養基中需要量極微，體內含量常在10－3－10－5 moi/l之間，培養基中新增10－7－10－5moi/l（摩/公升）就可滿足需要，多了就會引起植物細胞酶失活，代謝障礙，蛋白質變性及組織死亡。fe是用量較多的一種微量元素，對植物組織葉綠素的合成和延長生長起重要作用。因使用fe (so4)3（硫酸鐵）和fecl3（氯化鐵）在培養基ph為5.
2以上時fe (oh)3沉澱，植物材料無法吸收，故常用feso4.7h2o（硫酸亞鐵）和二乙銨四乙酸二鈉（na2-edta）結合成螯合鐵成為有機態被吸收和利用。
cu有促進離體根生長的作用；mo是合成活躍的硝酸還原酶的組成部分，也是固n酶的組成部分，還有防止葉綠素受破壞的作用；mg、zn、na、是酶的組成部分，也是防止葉綠素被破壞的作用；mn與植物呼吸作用、光合作用有關；b與糖的運輸，蛋白質合成有關，總之，微量元素在生命活動中，多以酶系中的輔基形成起重要作用。
（三）有機營養
1. 維生素類：大多數植物組織或細胞能夠合成必要的維生素，但是在數量上顯然是不夠的，通常在培養基中補加一種或多種維生素但各標準營養培養基所用維生素組合差別較大，常使用的有：
維生素b1（鹽酸硫銨素）用量0.1－5.0mg·l－1
維生素b6（鹽酸吡哆醇）用量0.1－1.0mg·l－1
維生素h（生物素） 用量0.01－1.0mg·l－1
菸酸用量0.1－5.0mg·l－1
肌醇用量100－200mg·l－1
核黃素用量0.1－1.0mg·l－1
植物組織培養實驗指導
2014.3 附錄培養基母液的配製 實驗老師準備 一 實驗目的 掌握培養基母液配製的方法。二 實驗原理 配製培養基時，為了使用方便和用量準確，通常採用母液法進行配製，即將所選培養基配方中各試劑的用量，擴大若干倍後再準確稱量，分別先配製成一系列的母液置於冰箱中儲存，使用時按比例吸取母液進行稀釋配製即可...
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植物組織培養實驗報告
實驗一母液的配置與儲存 一 實驗目的 通過配置ms培養基母液，掌握母液的配置和儲存方法 二 實驗原理 配置培養基時，為了使用方便和用量準確，通常採用母液法進行配置，即按培養基配方中各試劑的用量，擴大若干倍後再準確稱量分別先配製成一系列的母液置於冰箱中儲存，使用時按比例吸取母液進行稀釋配置即可。三 實...