國家重點基礎發展規劃專案
專案編號：g1998010200
專案名稱：農作物資源核心種質構建、重要新基因發掘與有效利用研究
首席科學家：賈繼增張啟發
課題編號：g1998010207
課題名稱：水稻抗病基因轉殖
課題負責人：翟文學
子課題負責人：翟文學彭開蔓（王石平）
承擔單位：中國科學院遺傳所，華中農業大學
電子信箱：
2023年9月30日
一、計畫任務完成情況
本課題的預期目標是分離轉殖2個水稻抗病基因。我們已經按計畫開展了研究工作，分別對水稻抗白葉枯病基因xa3、xa4、xa5、xa13、xa25(t)和xa26以及抗稻瘟病相關基因進行了轉殖研究。目前已轉殖並證實了xa26基因；已轉殖xa4和xa5基因，即將證實其功能；精細定位了xa3、xa13和xa25(t)基因；獲得了3個抗稻瘟病相關基因。
基本達到預期研究目標。
具體工作與取得的進展如下:
1. 精細定位了水稻抗白葉枯病基因xa4和xa26
我們利用f2大群體，分別對水稻抗白葉枯病基因xa4和xa26進行了遺傳分析和精細遺傳定位。這兩個基因都位於第11號染色體的長臂末端並緊密連鎖。涉及xa4基因（sun et al.
, 2003, theor. appl. ge***.
106:683-687）和xa26基因（yang et al., 2003, theor.
appl. ge***. 106:
1467-1472）遺傳分析的工作已發表。
2. 分離轉殖了水稻抗白葉枯病基因xa26
我們採用圖位轉殖法從水稻品種明恢63中分離轉殖了xa26基因（專利申請號：02139212.9）。
序列分析發現這該基因編碼lrr受體激酶類蛋白質。研究還發現，無論是在苗期還是成株期攜帶xa26基因的轉基因水稻的抗譜比xa26基因的供體水稻品種（明恢63）的抗譜顯著增寬，抗性明顯增強，說明遺傳背景可能影響抗病主效基因的作用。分離轉殖xa26基因的工作正在發表印刷之中（sun et al.
, 2003, plant j., in press）。另外，研究還發現攜帶抗白葉枯病基因xa3的近等基因系irbb3和攜帶抗白葉枯病基因xa22(t)的雲南地方稻品種扎昌龍也攜帶xa26基因。
因為xa3和xa22(t)基因也被他人定位於第11號染色體長臂末端，推測xa26、xa3和xa22(t)是同乙個基因，這部分驗證工作正在進行之中。
3. 分離轉殖了水稻抗白葉枯病基因xa4
我們採用圖位轉殖法從水稻近等基因系irbb4中分離轉殖了xa4基因（專利申請號：02139257.9）。
序列分析發現這該基因也編碼lrr受體激酶類蛋白質。xa4和xa26屬於同乙個基因家族的不同成員。抗性分析發現發現秈稻品種特青和93-11與irbb4的抗譜相同，序列分析發現特青和93-11也攜帶xa4基因。
轉基因初步實驗結果顯示遺傳背景可能也影響xa4基因的抗性。目前，這部分工作正在完善之中。
4. 分析了xa4和xa26所屬基因家族的進化
xa4和xa26基因所屬家族（命名：xa26基因家族）包括10個成員。我們對水稻品種明恢63和特青包含xa26基因家族的大約100 kb區段進行了測序，對比公共資料庫中的水稻品種日本晴和93-11的同源區段的序列，分析了抗病基因的進化模式。
涉及這部分工作的**正在撰寫之中。
5. 鑑定並精細定位了乙個水稻抗白葉枯病新基因xa25(t)
在雜交水稻恢復系明恢63中鑑定了乙個新的抗白葉枯病顯性基因xa25(t)。該基因在苗期和成株期都能特異性的抗白葉枯病菌生理小種pxo339。通過分析攜帶xa25(t)基因的重組自交系群體，將該基因定位於水稻第12號染色體的著絲粒區。
在該著絲粒區段已經定位了多個水稻抗稻瘟病基因，推測xa25(t)基因與抗稻瘟病基因緊密連鎖或等位。涉及xa25(t)基因的研究工作已發表（chen et al., 2002, phytopathology 92:
750-754）。
6. 構建了水稻全生育期平衡化cdna文庫
利用水稻品種明恢63，構建了全生育期平衡化cdna文庫。該文庫由水稻不同生長時期和不同生理狀態下的15種不同組織的cdna組成，包括白葉枯病菌和稻瘟病菌接種誘導後的組織。該文庫包含大約62,000個轉殖，平均插入片段為1.
4 kb （chu et al., 2003, chinese science bulletin 48:229-235）。
對該文庫中的大約4萬個cdna轉殖進行了測序， 獲得兩萬多個非重複est序列。利用該文庫我們建立了高效cdna晶元（包括cdna array和cdna microarray）分析體系。
7. 發展了一種新的est聚類方法
我們發展了一種新的計算機分析方法，用於分析大規模est測序中所產生的大量資料，以獲得高質量、非重複表達序列。該方法在聚類過程中採用megablast工具對一致序列進行序列同源比較，並用phrap程式對每一est簇進行拼接檢驗。這一聚類策略能降低測序錯誤帶來的影響，有效識別基因家族成員，並避免選擇性剪接的干擾。
與ncbi（national center for biotechnology information）的unigene clustering方法相比，estclustering的聚類結果可以更好地反映表達序列的多樣性。涉及這部分工作的**已經發表（張利達等，2003,遺傳學報30:147-153）。
8. 轉殖獲得了一批水稻抗性基因同源序列
利用植物nbs－lrr類抗性基因的高度保守區設計pcr引物從水稻基因組中擴增同源序列，經轉殖測序確定後獲得了23個不同的nbs片段（稱為抗性基因同源序列，簡記為rs）。將這些rs序列在窄葉青/京系17 的重組自交系（ril）構建的分子圖譜上定位，定位結果表明它們分布在1，3，4，7，8，9，10 和11染色體。其中10個rs位於已知r基因所在的染色體區間。
這些rs標記可以作為圖位轉殖同一位點上相應抗病基因的起點。有關結果已發表（zheng et al，2001,cience in china (series c), 44(3): 253-262）。
9．構建了含xa4、xa5和xa13三個抗性基因的irbb56基因組bac文庫
利用含xa4、xa5和xa13三個水稻白葉枯病抗性基因的累加系irbb56構建了乙個水稻細菌人工染色體文庫。該文庫包含55296個轉殖，平均插入片段為132 kb。按水稻基因組為450 mb計，該文庫覆蓋14倍基因組，篩選出任一水稻基因或序列的概率為99.
99％。用均勻分布的3個葉綠體基因和4個線粒體基因轉殖作探針篩選文庫，結果顯示該文庫中含細胞器基因組dna同源序列的轉殖數小於1％。用分布於水稻3條不同染色體、分別與xa4、xa5和xa13連鎖的dna標記篩選文庫，分別檢測出11--106個陽性轉殖，為轉殖這些基因打下了基礎。
該文庫對水稻基因組的高度覆蓋率和較大的插入片段，非常適合於物理作圖和基因的分離和轉殖（王文明等，2001，遺傳學報, 28(2)：120－128；wang et al., 2001, molecular ge***ics and genomics, 265:
118-125）。本研究中建立的提取高質量水稻基因組dna方法和高效轉化方法被成功地用於中國超級雜交稻測序(science, 2002,296: 79-92)。
10、轉殖了乙個nbs-lrr類抗性基因家族
用水稻抗白葉枯病基因xa4的近等基因系和基因累加係對轉殖的nbs-lrr同源序列rs13進行rflp分析，發現序列rs13來自xa4基因位點（wang et al, 2000, chinese science bulletin, 45(19): 1779-1782）。利用轉殖的抗病同源序列rs13作為探針，從水稻ir64的bac文庫中篩選到4個陽性轉殖，其中乙個轉殖14e19能夠覆蓋其餘3個轉殖。
對14e19進行了全序列測定和分析，獲得了73kb的全長dna序列，基因**顯示其上有4個編碼nbs-lrr的基因，分別命名為nl-a－d。同時,對近等基因系irbb56同一基因組位置的bac轉殖106p13進行分析，發現其上有10個nl同源拷貝，其中有4個同14e19上的nl一樣，說明nl是乙個至少有10個成員（分別命名為nl-a—nl-j）的基因家族。搜尋日本晴、93-11、廣陸矮4號的序列，發現三者也有多個高度同源的序列。
對nl基因進行rt-pcr和cdna庫篩選分析，發現nl-b能夠在含抗白葉枯病基因xa4水稻品系irbb4中特異表達，說明nl-b參與了白葉枯病抗性反應。把這些同源拷貝作為新的抗病基因進行研究，轉基因實驗正在證實這些同源拷貝的功能。
11、定位轉殖了隱性抗白葉枯病基因xa5的候選基因
本研究利用rflp、，構建了xa5的精細遺傳圖譜。在此基礎上我們用與xa5基因緊密連鎖的標記篩查含有xa5 的水稻累加系irbb56的bac文庫，構建了包含xa5基因位點的精細物理圖譜（zhong et al, chinese science bulletin, in press）。將xa5限定在12kb的片段上，在此區間發現唯一乙個候選基因，與已知抗病基因具有不同的結構。
該基因與顯性等位基因編碼的氨基酸序列有差異。目前功能互補實驗已獲得轉基因植株。
12．開展了抗白葉枯病基因xa3和xa13的精細定位與圖位轉殖
本研究利用ir24與含xa3基因的近等基因系irbb3組合構建了約2000單株的f2定位群體，，對xa3進行精細定位，將xa3基因定位於caps標記y3和ssr標記rm144之間，距y3約0.25cm，距rm144約1.0cm。
目前，我們又利用日本晴和irbb3組合構建了約5000單株的f2群體，對xa3基因作進一步精細定位。
利用xa13的近等基因系構建了包含4000單株的f2群體，將xa13基因界定在第8染色體80kb的區間。對這個區間進行dna測序和基因**，發現了可能的候選基因，正對這些候選基因進行共分離分析和功能互補分析，有望獲得突破。
13、分離轉殖了抗稻瘟病相關基因
本研究利用cdna-aflp和組池分離分析(bsa)相結合的方法來檢測稻瘟病抗池和感池中特異表達的基因。在大約20122個檢測到的位點中，一共獲得了12個差異表達的條帶(debs)，8個來自抗池，4個來自感池。利用水稻的dh群體對它們進行遺傳定位結果表明其中的5個debs，r1, r8, s9, s16和s17被定位在第一染色體的乙個抗稻瘟病的qtl所在的區間。
序列分析和等位分析發現r1和s16， r8和s9分別來自二對等位基因位點，而且r1(s16)， s17和r8(s9)分別位於第一染色體上三個緊密相連的bac/pac轉殖中，這更進一步證實了r1(s16)， s17和r8(s9)在第一染色體上qtl包含區間中的緊密連鎖關係。逆向northern blotting和定量rt-pcr分析表明r1(s16)， s17和r8(s9)在接種稻瘟病菌後的表達水平都是上調的，這暗示它們都參與了稻瘟病抗性反應過程。有關結果已投送國際學術刊物。
微型課題結題總結報告鄒虹
根據上面的問題，結合學校實施的教學改革，我們將有針對性地研究英語課堂上 聽寫在英語教學中的運用 讓學生盡可能輕鬆而又高效地在課堂上學到英語，運用英語，從而達到提高課堂教學質量的目的。三 研究的方法 從課題名稱就可看出我在本課題研究的過程中採取的是案例研究法 行動研究法 經驗總結法。我著重從以下幾個方...
總結報告 微型課題結題報告如何撰寫
微型課題的結題報告既是對研究結果的說明，又是研究的直接成果。它主要包含以下幾方面的內容 1.問題提出 主要闡明課題產生的過程，即我遇到了什麼問題，出於一種什麼考慮來研究這個課題。它主要交待課題提出的背景，說明選題原因和理由，交待研究目的和思路。同時，它需要從目標要求 現狀分析 研究目的這三個方面來回...
課題結題報告
3.明確思路 2011年底，課題組召開交流會，為了突出 課堂教學有效性 這個主題，在專家指導下，課題組認真研討，結合課題特點，及時明確思路，將研究重心下移到教師和學生，提出 學 觀 剖 修 四步策略。這一策略的明確提出，使得各組研究方向和內容趨於一致。4.實踐反思 課題實施階段，課題組成員圍繞 學 ...