應用於植物病原檢測的實時螢光定量pcr
張艷傑植物病理學 20131130029
摘要：實時螢光定量pcr技術是這些年興起的可以定量dna的新技術，廣泛應用於植物病原檢測、轉基因檢測、訊號轉導、植物抗病檢測、微生物指標等；本文綜述了實時螢光定量pcr技術的原理及其在植物病原菌檢測中的應用。
關鍵詞：實時螢光定量pcr 探針分子信標病原檢測
植物病害診斷和病原檢測對病害防治具有重要意義，只有明確了病原的種類及侵染時期，才能制定合理的防治策略，控制損失，而在病害發生前進行病害的早期診斷，能夠實現病害的早期預防和防治，從而採用及時的防治辦法，更好地控制病害的發生。傳統的檢測方法有平板稀釋法、酶聯免疫法、傳統pcr等，一般不能實現早期檢測，而且大多只能進行定性檢測。而近些年發展起來的實時螢光定量檢測技術，不僅可以進行定性，還可以進行定量，可以實現在病害未顯症時的早期微量檢測。
實時螢光定量pcr技術，是指在pcr反應體系中加入螢光基團，利用螢光訊號積累實時監測整個pcr程序，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。該技術於2023年由美國applied biosystems公司推出，該技術與常規pcr相比，具有許多優點[1]：第一，操作簡便，有較高的敏感性及快速高效；第二，由於擴增在封閉體系中完成並對其進行實時測定，因此降低了汙染的可能性。
第三，既可做定量分析，又可做定性分析；第四，可進行多重擴增，即通過不同的引物設計在同一反應體系中，同時對多個靶基因分子進行擴增；第五，可以在較大濃度範圍內（＞107倍）進行定量。miguel montes-borrego[2]等檢測了感染霜霉病的pap**er somniferum在未顯症時期，霜霉病菌（peronospora arborescens）的含量，結果確定，採用實時定量pcr的檢測精度為病原體生物量0.110-5557ppm。
suren k. samuelian[3]等採用實時定量pcr檢測葡萄上greeneria uvicola和colletotrichum acutatum的存在，實現了基因組dna 20fg和10個孢子的檢測精度。
在實時螢光定量中，根據螢光基團標記和實現能量共振轉移方式的不同，螢光pcr所用的探針可以分為taqman探針、雙鏈探針、分子信標、雜交探針、單標記螢光探針與雙鏈嵌入染料相結合的檢測模式，此外還有light-up、cyclicons、lux探針等。根據螢光產生的**不同可以分為兩類：一類是螢光標記探針，如taqman探針、分子信標等，都是建立在螢光能量共振轉移原理基礎上的；另一類是雙鏈dna特異的螢光染料，常用sybr green和lc green。
目前，實時螢光定量pcr技術常使用的螢光化學物質主要有三種：taqman（探針法），sybr green i（dna結合染料法），scorpion-pcr（蠍狀引物）。
taqman探針是一種寡核苷酸探針，也是一種水解探針，又叫外切核酸酶探針，這種探針的長度在20-24bp，根據末端標記的螢光淬滅基因不同，可分為普通的taqman探針和taqman mgb探針，它的螢光與目的序列的擴增相關，探針的5′端標記有螢光報告基因如fam，3′端標記有螢光淬滅基因如bhq，兩者構成能量傳遞，當探針完整時5′端報告基因經儀器光源激發的螢光正好被近距離的3′端螢光基團淬滅，而不出現螢光訊號變化，pcr擴增時，引物和探針都結合在模板上，探針在引物的上下游之間，隨著pcr反應，taq酶在延伸過程中遇到模板結合的探針，5′→3′端外切酶活性就會將探針切割，破壞兩個螢光分子間的能量傳遞，釋放5′端報告基因遠離3′端螢光淬滅基因的遮蔽，從而發射出螢光訊號，即每擴增一條dn**段，就有乙個螢光分子形成。這樣pcr產物與螢光訊號之間形成一一對應的關係，因為迴圈引數ct與起始模板數的對數成負相關，通過制定的標準曲線，再根據待測樣品的ct值就能確定起始模板的數量，因此，根據pcr反應體系的螢光強度就能準確的計算出起始模板的拷貝數。常規taqman探針有一定不足，主要表現在：
由於採用螢光和淬滅基團雙末端標記，因此淬滅難以徹底本底較高；報告基團的水解利用的是taq酶的5′→3′外切活性，因此定量時容易受酶活性影響，探針標記成本較高，不便普及應用。taqman mgb探針與常規taqman探針相比，其優點在於：探針在3′端採用非螢光淬滅基團本身不產生螢光，可以使螢光本底訊號的強度降低，探針上連線了mgb修飾基團使探針tm值，提高10℃度左右，因此為了獲得同樣的tm值mgb探針可以比普通taqman探針設計的更短，既降低了合成成本，也使探針設計的成功率大為提高。
thomas oberhnsli[4]等採用雙重taqman mgb檢測果樹和其它植物中的植原體，植原體陽性樣本在ct值為22-30時能夠被檢測出來。
sybr green i 螢光染料是擴增序列非特異性檢測的代表，sybr green i只與dna雙鏈的小溝結合，插入dna雙鏈時發出螢光訊號，而不與雙鏈dna結合的sybr green i染料不會發出螢光，即dna雙鏈解鏈時螢光訊號急劇減弱，因此，螢光訊號的強度與pcr擴增產物的增加同步。sybr green i在rt-pcr反應的過程是：開始反應時，sybr green i螢光染料與dna雙鏈接合發出螢光；dna變性時，sybr green i螢光染料釋放出來，螢光訊號減弱；在延伸完成後，sybr green i螢光染料與雙鏈產物結合，rt-pcr反應檢測到螢光的淨增量加大。
sybr green i在實時定量檢測方面有很多優點，由於它與所有的雙鏈dna相結合，僅需兩個用於擴增的引物，不需設計探針對其標記，成本更低廉，不必因模板不同而特別定製，設計的程式通用性比較好，但是sybr green i染料不僅能和任何雙鏈dna結合也能與非特異性擴增如引物二聚體結合，使檢測容易出現假陽性的情況，引物二聚體問題可以通過引物溶解曲線評價引物特異性，sybr green i對pcr擴增有一定的抑制作用，其螢光訊號強度相對較低，穩定性也相對較差。chiwan koo[5]等採用sybr green i實時螢光定量檢測了fusarium oxysporum spf. lycopersici、fusarium verticillioides、pseudomonas syringae pv.
syringae、pseudomonas syringae pv. tabaci、pseudomonas syringae pv. tomato、burkholderia glumae等六種植物病原真菌和細菌，檢出率很高，樣品需要量為5ng/8μl。
林銘[6]等根據番茄黃化曲葉病毒病（tomato yellow leaf curl virus disease，ty lcvd）的dna 保守序列設計引物，基於sybr green i檢測模式，構建了tylcv 實時螢光定量pcr 檢測體系，並且對接種病毒30d後的感病番茄植株中的tylcv進行檢測。結果顯示，1ng·μl-1感病番茄總dna中約含有3.47×106個病毒拷貝。
利用實時螢光定量 pcr 法比普通 pcr 法的靈敏度提高100倍。
分子信標又稱分子燈塔法，是一種根據螢光共振能量轉移原理建立起來的螢光定量技術，分子信標長約25nt，是一段能夠與靶標核苷酸序列互補的探針，它的空間結構成頸環結構，頸長約5-7nt，由與目標序列無關的互補序列構成，其一端連有螢光基團另一端連有淬滅基團。環序列是與靶標序列互補的探針；當沒有靶標序列時，分子信標呈現頸環結構，頸部的螢光基團與猝滅基團十分接近可以發生rfret；螢光基團發出的螢光被淬滅基團所吸收，此時並不能檢測到螢光訊號，當靶標序列存在時，環序列與靶標序列結合形成雙鏈結構比無靶標序列的頸環結構更穩定，這種結構使螢光基團與淬滅基團分開，螢光基團發出的螢光並不能被淬滅基團所吸收，因此，可以檢測到螢光訊號。分子信標有特異性強、靈敏度高、可以實時監測、省時方便和能夠對核酸進行大規模檢測等優點，但是其設計既要避免產生較強的背景螢光訊號又要避免頸部非靶標序列雜交過強，影響其與模板退火；且這種探針合成時標記困難，成本相對較高。
雙雜交探針又稱lightcycler技術，需要設計兩條螢光標記探針，將螢光分子和淬滅分子標記分別標記在兩個探針上，第一條探針的5′端標記螢光基團，第二條探針的3′端標記淬滅基團並且其3′端必須被封閉以阻止dna聚合酶以第二條探針為引物合成dna。兩條探針在目的基因上的互補序列是鄰近的。兩條探針首尾相連且兩條探針上螢光基團發出的螢光波長不同，當兩條探針都已結合上目的基因時，探針上的螢光基團被淬滅而淬滅基團被激發，螢光淬滅的程度與起始模板量成正比，從而進行定量分析。
dám horváth[7]等採用 lightcycler探針和非特異的sybr green進行多重實時定量pcr，在同乙個系統內檢測真菌、革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌，取得的重要進展。
scorpion-pcr是在分子信標的基礎上形成的一種蠍狀引物的螢光定量pcr技術，在引物與分子信標探針之間連線乙個間隔壁，使pcr延伸反應時不能夠延伸至信標分子，這樣非特異擴增產物便無螢光訊號；當有特異擴增產物時，信標分子即可與擴增產物進行分子內雜交，產生螢光訊號。
復合探針結合了雙雜交探針和分子信標的優點，同樣需要合成兩條探針，第一條探針的5′端連入螢光基團，第二條探針的3′端連入乙個螢光淬滅基團，第一條探針的螢光基團可以和第二條探針的淬滅基團雜交，當兩個探針結合時螢光基團發出的螢光訊號被淬滅基團所吸收因此不能檢測到螢光訊號；當兩個探針分開時，螢光探針發出的螢光訊號就不能夠被淬滅探針的淬滅基團吸收，因而能夠檢測到螢光訊號；當反應體系中沒有與之結合的模板時，兩個探針發生雜交，無螢光檢測訊號；當pcr反應體系中存在模板時，探針與模板結合而分開，從而有螢光訊號產生，螢光訊號的強度與模板的數量成正比，因而可以進行pcr定量。
目前研究人員利用taqman探針技術，分別檢測了苜蓿、土豆、大豆、玉公尺、辣椒、的一些病害；利用sybr green i螢光染料非特異性擴增，檢測了小麥、黃豆、水稻等的一些病原菌；同時利用scorpion-pcr分子信標檢測了柑橘根系、大麥、橄欖等的一些病原菌。
jo anne crouch[8]等運用實時定量pcr分析和檢測南方玉公尺銹病病原菌puccinia polysora和puccinia sorghi，檢測濃度從50pg到100ng，r2≥0.97。yachun su[9]等設計了特殊引物（beq-f/beq-r)和乙個taqman探針(beq-p），運用實時螢光定量技術檢測了甘蔗中的sporisorium scitamineum，檢測中，只需要10 ag pbe dna 和 0.
8 ng甘蔗dna，檢測精度大幅提高。菊苣假單胞菌（p. cichori）對結球期的萵苣造成侵染並引起典型的軟腐病症狀的濃度為 100 cfu·ml-1，cottyn[10]等基於hrcrst致病基因片段建立了一種靈敏的實時螢光定量pcr檢測灌溉水中菊苣假單胞菌的方法，檢測灌溉水中菊苣假單胞菌的靈敏度為1 cfu·ml-1，遠遠低於該病害的發病閾值，從而為萵苣軟腐病的早期**和預警提供資訊。
xu r[11]等基於丁香假單胞菌屬（p. syringae）細胞色素氧化酶輔酶基因序列差異建立的實時螢光定量 pcr 技術，可以特異檢測 8 種丁香假單胞菌致病變種病原菌（syringae，tomato，maculicola，tabaci，atropurpurea，phaseolicola，pisi，glycinea），檢測靈敏度為 100 fg，即 4.5×103cfu·ml-1，提高了檢測效率，並可以直接定量接種丁香假單胞菌番茄致病變種（p.
syringaepv. tomato）的番茄離體葉片中病原菌 dna 的含量。
基因的表達
高考考點3 基因的表達 本類考題解答錦囊本知識點抽象難理解，首先要弄清一條沒有複製的染色體上有乙個dna分子，乙個dna分子上有許多個基因，基因通過轉錄和翻譯控制蛋白質的合成，基固轉錄形成的信使rna,上有決定氨基酸的密碼子，其決定生物體內20種氨基酸的密碼子應有61種，因為有三種是終止密碼不決定氨...
基因的表達
前情回顧 1 1866年，孟德爾將自己歷時8年的雜交實驗成果整理成文，並提出 遺傳因子 我們現在稱其作 的概念。2 1903年，薩頓通過比較減數 中基因和染色體的行為，提出基因在 上，這一推理最終在1909年由摩爾根通過果蠅雜交實驗證明。3 1952年，赫爾希和蔡斯整合前輩經驗，通過的實驗，無可爭議...
基因的表達高三複習檢測卷
絕密 啟用前 2014 2015學年度高三單元練習卷 基因的表達 考試範圍 必修二第四章 考試時間 100分鐘 命題人 王建 注意事項 1 答題前填寫好自己的姓名 班級 考號等資訊 2 請將答案正確填寫在答題卡上 第i卷 選擇題 請點選修改第i卷的文字說明 1 下列關於基因和染色體關係的敘述,正確的...