改善營養性貧血功能評價方法
（徵求意見稿）
保健食品評價試驗專案、試驗原則及結果判定
items, principles and result assessment
改善營養性貧血功能
1 試驗專案
1.1 動物實驗
1.1.1 體重
1.1.2 血紅蛋白
1.1.3紅細胞比積/紅細胞游離原卟啉
1.2 人體試食試驗
1.2.1 血紅蛋白
1.2.2 血清鐵蛋白
1.2.3 紅細胞游離原卟啉/紅細胞運鐵蛋白飽和度
2 試驗原則
2.1 動物實驗和人體試食試驗所列指標均為必做專案。
2.2 針對兒童的人體試食試驗，只測血紅蛋白和紅細胞內游離原卟啉。
2.3 在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。
3 結果判定
3.1 動物實驗：血紅蛋白指標陽性，紅細胞游離原卟啉/紅細胞壓積二項指標一項指標陽性，可判定該受試樣品改善營養性貧血功能動物實驗結果為陽性。
3.2人體試食試驗
3.2.1針對改善兒童營養性貧血功能的，血紅蛋白和紅細胞內游離原卟啉二項指標陽性，可判定該受試樣品具有改善營養性貧血功能作用。
3.2.2針對改善**營養性貧血功能的，血紅蛋白指標陽性，血清鐵蛋白、紅細胞內游離原卟啉/血清運鐵蛋白飽和度二項指標一項指標陽性，可判定該受試樣品具有改善營養性貧血功能作用。
改善營養性貧血功能檢驗方法
method for the assessment of improving
nutritional anaemia function
1.動物實驗
1.1 原理
用低鐵飼料餵飼動物可形成實驗性缺鐵性貧血模型，再給予受試樣品，觀察其對血液細胞學、血液生化學等指標的影響，可判定該受試樣品對改善動物營養性貧血的作用。
1.2 實驗動物
健康初斷乳大鼠，單一性別，每組大鼠8-12只。
1.3 低鐵飼料
配方：* 亦可使用edta處理的酪蛋白
ain-93g混合礦物鹽配方
表3 ain-93g混合維生素配方
1.4劑量分組及受試樣品給予時間
實驗設三個劑量組和乙個低鐵對照組，以人體推薦量的5倍為其中的乙個劑量組，另設二個劑量組，必要時設陽性對照組（硫酸亞鐵或乳酸亞鐵，劑量為2ppm或2mg/(kgbw)，以fe元素計）。受試樣品給予時間30天，必要時可延長至45天。
1.5 實驗步驟
1.5.1 建立缺鐵性貧血大鼠模型
選用健康斷乳大鼠在實驗環境下適應3～5天後飼予低鐵飼料及去離子水（或雙蒸水），採用不鏽鋼籠及食罐，同時，採用剪尾取血法放血，5天一次，每次0.3~0.5ml。
實驗過程中避免鐵汙染。自第3周開始每週選取部分大鼠採尾血測hb，如多數動物hb低於100g/l時，測定全部大鼠的體重及hb。
1.5.2 恢復實驗
選取hb<100g/l的大鼠作為實驗動物，根據貧血大鼠hb水平和體重將其隨機分為低鐵對照組和三個實驗組，各組均繼續飼予低鐵飼料，低鐵對照組給予相應溶劑，實驗組分別給予不同劑量的受試樣品，受試樣品給予時間30天，必要時可延長至45天，測定體重及各項血液學指標。
1.6 觀察指標
體重、血紅蛋白、紅細胞比積/紅細胞內游離原卟啉
1.6.1 血紅蛋白測定（氰化高鐵法）
消光係數法和標準曲線法任選其一測定血紅蛋白。
1.6.1.1 消光係數法
1.6.1.1.1 原理
血紅蛋白（haemoglobin，hb）被鐵***氧化後生成高鐵血紅蛋白，再與氰離子結合形成氰化高鐵血紅蛋白（紅色）， 氰化高鐵血紅蛋白（紅色）極為穩定，在540nm波長下，毫克分子消光係數為44，據此，用分光光度法測其光密度，運用消光係數作血紅蛋白的定量測定。
1.6.1.1.2 儀器
721型或其它型號的分光光度比色計。
10微公升微量吸管。
1.6.1.1.3 試劑
稱取碳酸氫鈉（nahco3，ar）140毫克、鐵***200毫克、***50毫克，用水溶解並稀釋到1000毫公升。貯存於棕色試劑瓶內，在暗處或冰箱（4℃）儲存，至少可穩定數月到1年。
1.6.1.1.4 實驗步驟
1.6.1.1.4.1 取試劑2.5毫公升於5毫公升帶蓋試管中，加入10微公升血液，混勻後，放置15分鐘。
1.6.1.1.4.2 選用0.5厘公尺光徑比色杯，於540nm波長下，以試劑調零點，將所得樣品管之光密度乘以736，即為血紅蛋白濃度（g/l）。
計算公式如下：
ct =
ct=待測的血紅蛋白（g/l）濃度。
= 氰化高鐵血紅蛋白在540nm波長下測出的光密度。
251 = 測定時血液的稀釋倍數（血10μl加入試劑2.5ml中）
44 = 氰化高鐵血紅蛋白的毫克分子消光係數
0.5 = 比色杯的光徑
64458 = 血紅蛋白的分子量
1000 = 將（毫克/公升）換算成（g/l）的數字
1.6.1.1.5 注意事項
1.6.1.1.5.1 試劑不要放在聚乙烯瓶內，以免因氰離子與其反應而使試劑作用降低。
1.6.1.
1.5.2 儀器因mm消光係數法完全依靠儀器的吸光度來計算，故此法要求所用的儀器效能要符合要求（如儀器的波長準確與否，以及靈敏度及線性等），否則將直接影響測定的結果。
1.6.1.
1.5.3 儀器在使用前最好應以who規定的氰化高鐵血紅蛋白參考液校正後再使用。
參考液最好選用icsh（國際血液學標準化委員會）確定的由riv（荷蘭國立公共衛生研究院）製作的氰化高鐵血紅蛋白參考液或上海醫學化驗所製備的氰化高鐵血紅蛋白標準液。
1.6.1.2 標準曲線法
1.6.1.2.1 原理
血紅蛋白（hemoglobin，hb）在鐵***和***的作用下生成極為穩定的氰化高鐵血紅蛋白（紅色），其顏色深淺與血紅蛋白的含量成正比。用分光光度計在540nm波長下，測定血紅蛋白標準品和參考標準物質的吸光度，製成標準曲線，測得待測樣品的吸光度後查標準曲線即可得hb的濃度。
1.6.1.2.2 儀器
10μl血色素吸管（或定量毛細管）
5ml或10ml帶蓋試管
721、722、或723型等型號的分光光度計
1.6.1.2.3 試劑
稱取碳酸氫鈉（nahco3，ar）140mg、鐵***200mg、***50mg，用蒸餾水溶解並稀釋到1000ml，貯存於棕色試劑瓶內，儲存於4oc冰箱可穩定至1年。
1.6.1.2.4 實驗步驟
吸取2.5ml試劑於5ml帶蓋試管中，用10μl血色素吸管（或定量毛細管）取大鼠尾血或靜脈血10μl放置於已放入試劑的試管中；混勻放置15min。選用0.
5cm光徑比色杯，於540nm波長下，以試劑調節儀器零點，測定各樣品管的吸光度，同時測定血紅蛋白標準和參考標準物質的吸光度，繪製血紅蛋白的標準曲線。查標準曲線可求得待測樣品和參考標準物質的血紅蛋白含量(g/l)，計算參考物質的**率。
1.6.1.2.5 注意事項
1.6.1.2.5.1 不要將試劑放在聚乙烯瓶內，以免因氰離子與其反應而使試劑作用降低。
1.6.1.2.5.2 不宜直接使用消光係數方法計算血紅蛋白的含量，因為儀器的波長準確與否儀器的靈敏度和線性等因素均直接影響測定結果。
1.6.1.2.5.3 每次測定時，在不同間隔反覆測定血紅蛋白標準液和參考標準物質（低、中、高3個濃度）。
1.6.1.3 資料處理及結果判定
實驗資料可用方差分析，但需按方差分析的程式先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算f值，f值< f0.05，結論：各組均數間差異無顯著性；f值≥f0.
05，p≤0.05，用多個實驗組和乙個對照組間均數的兩兩比較方法進行統計；對非正態或方差不齊的資料進行適當的變數轉換，待滿足正態或方差齊要求後，用轉換後的資料進行統計；若變數轉換後仍未達到正態或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統計。
結果判定
受試樣品組與對照組比較，血紅蛋白濃度公升高經統計處理差異有顯著性，且受試樣品組前後公升高幅度平均達到10g/l以上，判定該實驗結果陽性。
1.6.2 紅細胞內游離原卟啉測定
1.6.2.1 原理
血紅蛋白的合成過程中，幼紅細胞中的原卟啉在血紅素合成酶的作用下與鐵結合，當鐵**不足時，紅細胞內的原卟啉乃以游離形式累積起來超過正常水平。因此，檢測紅細胞內游離原卟啉（free erythrocyte proloporphyrin， fep）的含量是檢查缺鐵性紅細胞生成的有效方法。
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