1. pcr反應
取1 l逆轉錄產物為模板，在25 l pcr擴增反應體系中先將模板於97℃變性5 min（熱啟動過程），加入taq dna 聚合酶，在pe 2400 pcr熱迴圈儀中迴圈35次。
pcr反應體系：
ddh2o15.5 l
10緩衝液2.5 l
mgcl21.5l
dntps(2.5 mmol/l2.0 l
cdna模板1.0 l
上游引物(10 pmol/l1.0 l
下游引物(10 pmol/l1.0 l
taq dna聚合酶（5 u /l）：0.5 l
迴圈引數：94℃，30s；x℃，30s；72℃，1 min；迴圈35次，最後乙個迴圈在72℃延伸7 min。
2. pcr產物經瓊脂糖電泳純化和膠**（參照膠**試劑盒說明）
3. pcr產物直接與商品化t載體連線。
連線體系：10l中：pcr產物 7.5l
t載體0.5l
10 ligase buffer 1.0 l
t4 ligase1.0 l
dn**段的連線
dn**段通過用每一種限制性內切酶過量消化底物dna而獲得。這些片段隨後用t4 dna連線酶連線( 5′ 末端濃度為0.1-1.
0 μm)。連線的片段然後用同一種限制性內切酶重切
4. 轉化
10l連線產物與200 l感受態細胞混勻，冰浴30 min，
42℃水浴90 s，迅速冰浴2 min，
加入600 l lb（無amp），37℃培養45-60 min，3,600 rpm離心5 min，棄650 l，剩餘部分重新懸浮，鋪板接種，37℃培養12-16 hr。
下面的簡單方案是clhen等（1972）所用方法的變通方案，常用於成批製備感受態細菌，這些細菌可使每微克螺旋質粒ｄｎａ產生5x106-2x107個轉化菌落，這樣的轉化效率足以滿足所有在質粒中進行的常規轉殖的需要。該方法完全適用於大多數大腸桿菌菌株，並且比方案ｉ快速，重複性更好。該法製備的感受態細胞可貯存於-70℃，但儲存時間過長會使轉化效率在一定程度上受到影響。
１）從於37℃培養16-20小時的新鮮平板中挑取乙個單菌落（直徑２－３mm），轉到乙個含有100ml lb或sob培養基的1l燒瓶中。於37℃劇烈振搖培養約３小時（旋轉搖床，300轉/分）。為得到有效轉化，活細胞數不應超過108細胞ml，可每隔20-30分種測量od600值來監測培養物的生長情況。
在菌株與菌株之間，ｏｄ600值和每毫公升中活細胞數間的關係變化很大，因此有必要通過測量特定大腸桿菌菌株的生長增減物在生長週期的不同時相的ｏｄ600值，並將各黧度的增減物鋪於無抗生素的ｌｂ瓊脂平皿以計算每一時相的活細胞數，從而使分光光度讀數得到標化。
２）在無菌條件下將細菌轉移到乙個無菌、一次性使用的、用冰預冷的50ml聚丙烯管（falcon 2070）中，在冰上放置10分鐘，使培養物冷卻至０℃。切記：下述所有步驟均需無菌操作。
３）於４℃用sorvall gs3轉頭（或與其相當的轉頭）以4000轉/分離心10分鐘，以**細胞。
４）倒出培養液，將管倒置１分釧以使最後殘留的痕量培養液流盡。
５）以10ml用冰預冷的0.1mol/l cacl2重懸每份沉澱，放置於冰浴上。我們發現將１mol/l cacl2貯存液[用純水（ｍille-q級或與其相當的級別）配製]以10ml小份貯存於-20℃煞是方便。
製備感受態細胞時，取一小份融化，用純水稀釋至100mlk，用nalgene濾器（0.45μm孔徑）過濾除菌，然後驟冷到０℃即可。對於大多數大腸肝菌菌株（除ｍｃ1061外），在這一步採用tfb（見表1.
3）代替氯化鈣可得到相同的或更好的結果。
６）於４℃以4000轉/分離心10分鐘，以**細胞。
７）倒出培養液，將管倒置１分鐘以使最後殘留的痕量培養液流盡。
８）每50ml初始培養物用2ml用冰預冷的0.1mol/l cacl2[或ｔｆｂ，見表1.3和步驟５]注]重懸每份細胞沉澱。
此時，可將細胞分成小份，放於-70℃凍存[有關討論請參見53頁本節（二）步驟11]在這些條件下，儘管長期儲存後轉化效率會稍有下降，但細胞仍可保持處於感受態。dagert和ehrlich(1979)曾表明細胞可以於４℃在cacl2溶液中儲存24-48小時，在貯存的最初12-24小時內，轉化效率增加３－５倍，然後降低到初始水平。
９）用冷卻的無菌吸頭從每種感受態細胞懸液中各取200μl轉移到無菌的微量離心管中，每管加ｄｎａ（體積∞10μl,ｄｎａ∞50ng），輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30分鐘。
10）將管放到預加溫到42℃的迴圈水浴中放好的試管回上，恰恰放置90秒，不要搖動試管。
11）快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻１－２分鐘。
12）每管加800μlｓｏｃ培養基（見附錄ａ）。用水溶將培養基加溫至37℃，然後將管轉移到37℃搖床上，溫育45分鐘細菌復甦，並且表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因。如果要求更高的轉化效率，在復甦期中，應溫和地搖動細胞**速不超過225轉/分）。
13）將適當體積（每個90mm平板可達200μl）已轉化的感受態細胞轉移到含20mmol/l mgso4和相應抗生素的ｓｏｂ瓊脂培養基上。如培養物體積太小（〈10μl〉。可再加肉湯培養基，用一無菌的彎頭玻棒輕輕地將轉化的細胞塗到瓊脂平板表面。
如在乙個90mm平板上鋪200μl以上的感受態細胞，應離心濃縮細胞，然後用適量ｓｏｃ輕輕重懸細胞。如用四環素抗性作為選擇標記，全部的轉化混合物可以鋪在乙個單獨的平皿上（或鋪在軟瓊脂中）。然而如選用氨苄青黴素抗性，則只能將一部分培養物（根據實驗決定）鋪在單獨的平皿上。
氨苄青黴素抗性功的增加與平皿上所加細菌數的增加並無線性比例關係，這可能是因為被抗生素殺死的細胞可釋放生長掏物質的緣故。
14〉將平板置於室溫直至液體被吸收。
15〉倒置平皿，於37℃培養，12-16小時後可出現菌落。如檢查氨苄青黴素抗性，用轉化細胞鋪增板時密度較低（每個90mm平板不超過104菌落），於37℃培養平板時不應超過20小時。氨苄青黴素抗性的轉化可將β－內醯胺酶分泌到培養基中，迅速滅活菌落周圍區域中的抗生素。
這樣，鋪平板時密度太高或培養時間太長都會導致出現對氨苄青黴素敏感的衛星菌落。在選擇培養基中不用氨苄青黴素而改用羧苄青黴素，以及將抗生素濃度從60μg/ml增至100μg/ml，可使情況有所改善，但不能徹底**之。
5. 提取質粒（參照質粒**試劑盒說明）
6. 酶切鑑定
酶切體系： 質粒 5-8l
10 buffer 1.5 l
e10.25 l
e20.25 l
ddh2o： 5-8 l
酶活性單位是指在50μl 的反應體系裡，採用隨酶提供的 ne buffer，用1個小時的時間，徹底消化1μg底物dna所需要的酶量。
7. 融合蛋白的表達：
（1）重組表達質粒轉化dh5α感受態細胞。
（2）分別挑取單菌落接種於5 ml lb ( 0.1 g·l-1 氨苄青黴素)中，37℃培養過夜。
（3）以2 %體積比轉接於200 ml lb( 0.1 g·l-1 氨苄青黴素)中，37℃繼續培養2.5 hr，至細菌對數生長期，加0.
1 mmol/l iptg 200 l誘導3-4 hr。
（4）12,000 rpm離心10 min收取菌體沉澱。
重組蛋白的可溶性分析：
（1）分別取0.3 g表達融合蛋白的菌體，重懸於3 ml裂解緩衝液中，加入pmsf至終濃度為10 mmol/l，冰浴超聲裂菌60 hz，5次，每次15 s。
（2）4℃ 12,000 rpm離心30 min；分別取上清和沉澱加入2×加樣緩衝液，煮沸10 min變性，12,000 rpm離心10 min。
（3）分別取變性後的上清和沉澱樣品10 l進行sds-page電泳分析（9-12%）。
*小量融合蛋白的誘導表達
（1）重組表達質粒轉化dh5α感受態細胞。
（2）分別挑取單菌落接種於5 ml lb ( 0.1 g·l-1 氨苄青黴素)中，37℃培養過夜。
（3）以2 %體積比轉接於2 ml lb( 0.1 g·l-1 氨苄青黴素)中，37℃繼續培養2.5 hr，至細菌對數生長期，加0.
1 mmol/l iptg 2 l誘導3-4 hr，同時設立不加iptg誘導作為對照。
（4）取1 ml 菌液,12,000 rpm離心10 min收菌體沉澱。
（5） 重懸於冰的100 l pbs中，加入pmsf至終濃度為10 mmol/l. **器**混勻，加入2×加樣緩衝液，煮沸10 min變性，12,000 rpm離心10 min。
（6）分別取誘導前和誘導後的樣品10 l進行sds-page電泳分析（9-12%）。
實驗一質粒dna的提取
[實驗目的]
通過本實驗掌握鹼裂解法提取質粒。
[實驗原理]
鹼裂解法提取質粒是根據共價閉合環狀質粒dna與線性染色體dna在拓撲學上的差異來分離它們。在ph值介於12.0~12.
5這個狹窄的範圍內，線性的dna雙螺旋結構解開而被變性，儘管在這樣的條件下，共價閉合環狀質粒dna的氫鍵會被斷裂，但兩條互補鏈彼此相互盤繞，仍會緊密地結合在一起。當加入ph4.8的乙酸鉀高鹽緩衝液恢復ph至中性時，共價閉合環狀的質粒dna的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復性迅速而準確，而線性的染色體dna的兩條互補鏈彼此已完全分開，復性就不會那麼迅速而準確，它們纏繞形成網狀結構，通過離心，染色體dna與不穩定的大分子rna，蛋白質-sds複合物等一起沉澱下來而被除去。
[儀器、材料與試劑]
（一） 儀器
1、 恆溫培養箱
2、 恆溫搖床
3、 台式離心機
4、 高壓滅菌鍋
（二） 材料
1.葡萄糖
2.三羥甲基氨基甲烷（tris）
3.乙二胺四乙酸（edta）
4.氫氧化鈉
5.十二烷基硫酸鈉（sds）
6.乙酸鉀
7.冰乙酸
8.乙醇
9.鹽酸（hcl）
菌株11.吸頭、小指管
（三） 試劑
1、 溶液i
50mmol/l 葡萄糖
5 mmol/l三羥甲基氨基甲烷（tris）tris·hcl
10mmol/l 乙二胺四乙酸（edta）（ph8.0）
2、 溶液ii
0.4mol/l naoh , 2% sds ,用前等體積混合
3、 溶液iii
5mol/l乙酸鉀 60ml
冰乙酸11.5ml
水28.5ml
4、 te緩衝液
10mmol/l tris·hcl
1mmol/l edta(ph8.0)
5、 70%乙醇（放-20℃冰箱中，用後即放回）
[實驗步驟]
（一） 提取質粒
1、 將bt菌株接種於lb液體培養基中，30℃振盪培養過夜。
2、 取1ml培養物倒入eppendorf管中，12000r/min離心30sec。
3、 吸去培養液，使細胞沉澱盡可能乾燥。
4、 將細菌沉澱懸浮於100μl冰預冷的溶液i中，劇烈振盪。
5、 加200μl溶液ii（新鮮配製），蓋緊管皿，快速顛倒5次，混勻內容物，將eppendorf管放在冰上。
6、 加入150μl溶液iii（冰上預冷），蓋緊管口，顛倒數次使混勻，冰上放置5min。
7、 12000r/min，離心5min，將上清夜轉至另一eppendorf管中。
8、 向上清夜加入2倍體積乙醇，混勻後，室溫放置5~10min。12000r/min離心5min。倒去上清夜，把eppendorf管倒扣在吸水紙上，吸乾液體。
9、 用1ml 70%乙醇洗滌質粒dna沉澱，振盪並離心，倒去上清夜，真空抽乾或空氣中乾燥。
10、50μl te緩衝液，使dna完全溶解，-20℃儲存。
[實驗安排]
本實驗一天內可做完。實驗結果可結合下乙個實驗一起觀察。
實驗二瓊脂糖凝膠電泳檢測dna
[實驗目的]
通過本實驗學習瓊脂糖凝膠電泳檢測dna的方法。
[實驗原理]
dna分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。dna分子的高於等電點的ph溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由於糖-磷酸骨架在結構上的重複性質，相同數量的雙鏈dna幾乎具有等量的靜電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動。
在一定的電場強度下，dna分子的遷移速度取決於分子篩效應，即dna分子本身的大小和構型。具有不同的相對分子質量的dn**段泳動速度不一樣，可進行分離。dna分子的遷移速度與相對分子質量的對數值成反比關係。
凝膠電泳不僅可分離不同相對分子質量的dna，也可以分離相對分子質量相同，但構型不同的dna分子，如puc19質粒，有3種構型：超螺旋的共價閉合環狀質粒dna（covalently closed circular dna,簡稱cccdna），開環質粒dna，即共價閉合環狀質粒dna 1條鏈斷裂（open circular dna ,簡稱ocdna），線狀質粒dna，即共價閉合環狀質粒dna2條鏈發生斷裂（linear dna,簡稱l dna）。這3種構型的質粒dna分子在凝膠電泳中的遷移速度不同。
因此電泳後呈3條帶，超螺旋質粒dna泳動最快，其次為線狀dna，最慢的為開環質粒dna。
分子轉殖實驗步驟總結
1.對目的片段進行pcr擴增 pcr體系 50l dna template10 100ng 10 pcr buffer5l 50mm dntps0.5l primers1m each wateradd to 49l taq polymerase1l 2.瓊脂糖電泳，看有無目的條帶 3.對目的條帶進行...
質粒DNA抽提實驗報告
一 實驗目的 1.掌握鹼裂解法小量快速提取質粒dna的方法，提取的質粒dna可直接用於酶切，pcr擴增等。2.學習利用水平式瓊脂糖凝脈電泳初步檢測dna的純度，構型，含量和分子量大小。二 實驗原理 鹼變性抽提質粒dna是基於染色體dna與質粒dn結果a的變性與復性的差異而達到分離目的。在ph值高達1...
質粒DNA的提取 定量 酶切與PCR鑑定實驗報告
一 實驗目的 1.學習並掌握用鹼裂解法提取質粒dna的方法 2.學習並掌握了解質粒酶切鑑定的方法 3.學習並掌握紫外吸收檢測dna濃度和純度的原理和方法 4.學習並掌握pcr基因擴增的實驗原理和操作方法 5.學習並掌握水平式瓊脂糖凝膠電泳的原理和使用方法。二 實驗原理 1.pcr 多聚酶鏈式反應 在...